多肽类药物鼻腔给药研究进展
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医院药学杂志作者
*壮张慧刘楠高翔曹艳高静郑爱萍湖北中医医院毒物药物研究所摘要
随着生物制药技术的发展，越来越多的多肽类药物在医药领域得到应用。但由于这类药物稳定性不佳、口服易被酶解等问题，临床多采用注射途径给药。鼻腔给药不仅能够克服口服给药的首过效应、注射给药的顺应性差等问题，而且具有脑靶向、低剂量高活性的优点。本文主要就多肽类药物的鼻腔给药进行综述，系统地介绍了鼻腔的组织构造；药物本身性质、制剂的特性和鼻腔内环境对药物鼻腔吸收的影响；以及通过添加吸收促进剂、酶抑制剂和设计成不同药物载体等方法改善药物鼻腔吸收，并叙述了鼻腔给药的研究热点-鼻脑传递，为后续相关制剂研发提供参考。关键词
生物制药；多肽类药物；脑靶向；鼻腔给药_正文_多肽类药物是由10~个氨基酸通过肽键连接而成的化合物，多为亲水性的极性大分子，因其高活性低毒性，已越来越多地用于各种疾病的治疗[1-2]。但蛋白多肽类药物经口服给药时，需要通过各种生物屏障[3-4]（如肠上皮细胞膜、肠腔内消化液、消化道酶等），由于胃液的破坏、消化道酶的降解以及难以透膜等问题，因而生物利用度极低，譬如年获批的首个口服多肽索马鲁肽的体内生物利用度不足1%[5-6]。基于此，临床上多采用注射途径给药，但考虑到治疗周期长，患者频繁注射顺应性差，因此多肽类药物给药途径的研究热点仍聚焦于基于鼻黏膜、肺黏膜、直肠黏膜等的黏膜递送[7-9]。鼻腔给药具有吸收迅速、起效快、可避免肝脏首过效应、生物利用度高、使用方便以及可绕开血脑屏障向脑内直接递送药物等优点。上市的鼻黏膜给药的多肽类药物包括鲑降钙素鼻喷喷雾剂和醋酸去氨加压素鼻喷雾剂，处于临床研究阶段的多肽类药物有特立帕肽鼻喷雾剂和胰岛素鼻喷雾剂等，如表1。本文通过查阅相关文献，总结了影响蛋白多肽类药物鼻腔给药的影响因素和改进方法，为蛋白多肽类药物鼻腔给药制剂的研究开发提供参考。1
鼻腔
人的鼻腔被鼻中隔分成两个腔室，如图1。鼻腔有三个主要部分：前庭、呼吸区和嗅觉区，总面积约cm2；（1）鼻腔最前面的部分是鼻前庭，鼻毛在此对吸入的空气进行过滤，减少尘埃等有害物质的吸入。（2）鼻腔最大的部分是呼吸区，其黏膜面积约占鼻腔黏膜总面积的5/6，且血管化程度高，为药物吸收进入全身循环提供了途径。许多上皮细胞的顶端表面覆盖着微绒毛，其主要部分也有细小的突起，称为纤毛。不同类型的上皮组织覆盖鼻黏膜：复层鳞状上皮、假复层柱状上皮或呼吸上皮和中间型[13-14]。呼吸上皮由有或无纤毛的柱状细胞、含杯状细胞的粘液和基底细胞组成。上皮下可见厚固有层。它是由一个松散的网状纤维弹性结缔组织组成，包含许多血管、神经和腺体。腺体有浆液和粘液分泌细胞，它们直接释放到表面，呼吸上皮被粘液层覆盖。纤毛上皮上有粘液层，纤毛在下层移动，而上层由纤毛运输[15]。纤毛浸入粘液的凝胶层，随着纤毛的跳动，将凝胶层中颗粒、刺激物和药物输送到鼻咽，在那里被吞咽[16]。粘液层中截留的颗粒与之一起运输，从而有效地从鼻腔中清除。粘液层和纤毛的联合作用称为粘液纤毛清除，如图2所示。一方面鼻腔前部非纤毛区清除较慢，滞留于此的异物缓慢地由粘液层进入纤毛区，纤毛清除系统以平均6mm·min-1速度随流动向后清除物质。对维护鼻腔安全有重要意义；另一方面，粘液纤毛清除也负责正常的鼻腔给药从鼻腔到鼻咽的快速清除。因此，粘液纤毛清除是鼻腔给药后药物吸收的相反过程，可逆性地抑制粘液纤毛清除将有助于药物的经鼻吸收。鼻腔吸收一般认为有两种机制[17]。第一种机制涉及水的运输途径，也被称为细胞旁途径，该过程较为缓慢，且依赖于药物的浓度，为被动转运过程。第二个机制即跨细胞过程，主要运输亲脂性药物，这些药物的经鼻吸收显示出对其亲脂性的依赖性。药物主要通过载体介导的方式通过主动转运途径穿过细胞膜。2
影响药物在鼻腔吸收的因素
2.1药物性质药物的理化性质在很大程度上决定了该药物是否能够经过鼻腔吸收，从而进入全身循环或中枢神经系统，其中最关键的因素即药物的分子量和亲脂性。2.1.1分子量影响药物鼻腔吸收最为重要的因素之一就是分子量大小。Mcmatin等[17]通过给大鼠鼻腔灌注分子量为Da（Dalton，道尔顿）的多肽以及分子量为Da的蛋白质，得到生物利用度分别为73%和0.6%，以此建立数学模型并总结出当分子量小于0Da时，药物鼻腔给药吸收效果较好。Hussain等[18-19]通过对普萘洛尔（小分子）和睾酮激素（分子量Da）的鼻腔给药研究，说明了分子量小于0Da时，无论该药物是否为多肽，经鼻给药时都会有较好的吸收。当分子量大于0Da时，鼻黏膜给药生物利用度都比较低（绝对生物利用度不足5%）。Cremaschi等[20]进行了体外研究，以探讨分子量为和Da的两种肽分子——依降钙素和促肾上腺皮质激素在兔鼻黏膜的摄取路径，其结论为这两种肽是通过上皮紧密连接的细胞旁转运和受体介导的细胞内吞作用摄取，并不是通过跨细胞摄取转运。分子量大的药物若跨膜进入细胞，会在细胞质内形成高渗环境，难以进一步透过，所以细胞旁通路或载体蛋白介导是其透过鼻黏膜的主要途径。2.1.2亲脂性药物的亲脂性也会对鼻腔上皮细胞吸收扩散产生影响。分子量较小的肽（小于0Da）鼻腔吸收基本不受亲脂性影响，此时分子量占主导，可以很容易地透过鼻黏膜吸收。如Hussain等[21]研究L酪氨酸及其甲酯的油水分配系数、体外水解速率和从大鼠鼻腔消失的速率，尽管两个相似肽的分配系数相差倍，但它们的被动吸收速率是相同的。故得出结论提高不稳定肽的亲脂性可能不会从鼻腔获得更好的生物利用度。产生这种现象的原因是分子量小于0Da时，细胞被动扩散，亲脂性基本不产生影响。分子量较大（大于0Da）的肽鼻腔吸收需要借助载体蛋白，向制剂中加入表面活性剂以改变油水分配系数，从而提高大分子的鼻腔吸收[22]。2.2制剂特性不止药物本身的理化性质，制剂的特性也会对鼻吸收产生重要影响。药物本身理化性质难以改变，可以从处方角度改变制剂性质，以适应鼻腔环境、促进鼻吸收。处方对鼻吸收的影响以制剂pH、渗透压和粘度为主。2.2.1制剂pH正常人鼻上皮细胞本身的pH值是微酸性的，在5.5到6.5之间[23]。调节制剂pH值可以改善鼻吸收，但需要考虑pH对鼻上皮细胞完整性的影响，特别是需要长期使用的药物。Pujara等[24]对大鼠鼻腔灌注pH2~12的磷酸盐缓冲溶液，检测细胞内乳酸脱氢酶和5-核苷酸酶的释放，结果表明pH值为3~10的磷酸盐缓冲液灌注后细胞内乳酸脱氢酶和5-核苷酸酶的释放最少，对组织学损伤小，与之前报道的大鼠鼻黏膜的pH值为7.39吻合[25]。Ohwaki等[26]考察了不同pH条件对鼻分泌物吸收的影响，发现酸性条件下对鼻分泌物吸收的增强是由鼻黏膜损伤引起的，即通过增加鼻上皮细胞膜通透性来增强鼻分泌物吸收。而且鼻吸收速率小于纤毛清除速率的药物，不仅要考虑pH值对鼻黏膜刺激性，还应考虑长时间pH值改变对鼻黏膜的结构损伤是否可逆。2.2.2渗透压制剂的渗透压也会对鼻吸收产生影响，等渗条件下并不一定能使药物达到最大吸收，有时偏离等渗也会促进药物吸收。虽然高渗或者低渗都可以促进药物吸收，但对鼻黏膜刺激性会有显著区别。低渗溶液会引起细胞肿胀大量乳酸脱氢酶渗出，从而改变上皮细胞旁的通透性，并有助于药物通过黏膜的渗透。Dua等[27]将不同渗透压的鲑降钙素制剂兔鼻腔灌注，发现高渗制剂（mOsm·kg-1）和低渗制剂（mOsm·kg-1）在不同粘度下的吸收与等渗制剂有显著差异。在低渗和高渗条件下，药物的生物利用度提高了4~5倍。Dufes等[28]研究发现，随着溶液趋于等渗，经鼻给药的血管活性肠肽的脑摄取显著降低。20mOsm·kg-1的血管活性肠肽溶液与mOsm·kg-1的血管活性肠肽溶液相比，脑摄取量增加了大约5倍。虽然改变渗透压可以提高药物的吸收，但要考虑对鼻黏膜安全性的影响。渗透压的变化会导致上皮细胞膨胀或收缩，从而损害上皮的完整性。Pujara等[24]通过测定总蛋白和乳酸脱氢酶、胞浆酶和5′-核苷酸酶两种酶在灌流过程中的释放量，观察鼻黏膜刺激性。发现低渗溶液会引起细胞肿胀大量乳酸脱氢酶渗漏[29]，从而改变上皮细胞旁的通透性，并有助于药物通过黏膜。而高渗溶液（mOsm·kg-1）会导致大量粘液分泌[30]。由于鼻上皮细胞渗透压为mOsm·kg-1，一般认为制剂渗透压在~mOsm·kg-1范围内，对鼻腔上皮细胞刺激和损伤最小。2.2.3粘度粘度是另一个在鼻腔制剂组成中可改变的参数。粘度会增加喷雾的液滴尺寸，液滴尺寸越大，药物在鼻腔越容易沉积。Dua等[31]发现鲑降钙素在不同粘度条件下，达峰时间（tmax）会发生显著改变，分别从40min变化到58min以及从90min变化到min。Harris等[32]人发现大鼠鼻腔给予去氨加压素，使用0.25%（w/v）甲基纤维素作为增粘剂时，达峰时间（tmax）会延长。然而药时曲线下面积没有显著性差异，即药物生物利用度没有提高，这可能是由于较高的粘度导致药物从制剂中扩散延迟而造成的。2.3鼻内环境虽然鼻腔给药避免了肝脏的首过效应，但鼻黏膜的酶屏障可产生“假首过效应”。鼻腔具有较高的蛋白水解酶活性、纤毛清除率以及粘液变化，这些都对药物鼻吸收产生影响。2.3.1酶活性多肽类药物鼻腔给药绕过了肝脏的代谢和胃肠道的高蛋白酶水解环境，但鼻腔中存在多种酶如氨肽酶、单加氧酶、还原酶、转移酶、酯酶和蛋白水解酶等通过影响多肽药物稳定性，改变其生物利用度[33-35]。Morimoto等[36]研究发现鲑降钙素与抑肽酶、氨肽酶或亮肽联合使用鼻腔给药可提高提高鲑降钙素的鼻吸收，从而提高低钙血症的效果。Sarkar等[37]用包括人类鼻腔上皮细胞在内的几种细胞作为研究对象，观察在细胞色素P-酶条件下各种细胞的活性，结果发现鼻上皮嗅区细胞色素P-含量虽然低于肝脏，但其催化活性高于肝脏，防止外源性物质涌入鼻腔，从而证实鼻黏膜中的肽酶和蛋白酶活性阻碍了多肽药物的传递。2.3.2纤毛清除鼻吸收的一个主要限制是鼻腔内纤毛的快速清除。上皮细胞表面的纤毛以每分钟0次的速度协同工作，清除鼻腔到咽部的黏液。正常鼻腔的周转率约为每10分钟一次[38]。鼻腔给药促透剂选择暂时性抑制纤毛清除，以促进药物鼻腔吸收。Longenecker[39]认为浓度为1%（w/v）的牛磺酸钠是大鼠、兔子和绵羊鼻内注射胰岛素的有效促进剂。然而，在体外用光电法测量人纤毛腺样体组织时，发现牛磺酸钠对人的纤毛腺样体组织有明显的抑制作用，在0.3%（w/v）及更高浓度下诱导纤毛停止，推断其促透作用与纤毛抑制作用密切相关。2.3.3鼻粘液粘液与纤毛紧密连接，是维持鼻腔健康的重要物质，其中含多种成分[40-42]，具有维持鼻腔微环境稳定的作用，如表2。正常粘液有两层：第一层为凝胶层，又称睫状层；第二层为水层。当制剂刺激鼻黏膜，破坏凝胶层，水层会大量释放，稀释药物，然后通过纤毛摆动吞咽清除，使药物鼻腔停留时间尽可能短，起到保护鼻黏膜的作用。3
改善药物在鼻腔中鼻吸收方法
随着制剂工艺发展，从药物角度出发，改善鼻腔吸收的方法大致上可分为两大类。一是改变制剂组成，即向制剂中加入吸收促进剂、蛋白酶抑制剂等；二是设计药物载体保护多肽药物。3.1吸收促进剂添加吸收促进剂可改善肽类药物鼻吸收，如表面活性剂、环糊精、胆盐[43-47]。Sakr等[48]研究发现不含吸收促进剂的胰高血糖素以喷雾溶液或干粉制剂的形式家兔给药后的相对生物利用度分别为0.8%和3.5%；然而，在喷雾溶液和干粉制剂中加入5%的二甲基-β-环糊精后，相对生物利用度分别提升至82.2%和82.8%。由于吸收促进剂的作用机制不同，药物鼻吸收的效果以及加入吸收促进剂之后鼻上皮组织的形态结构都会有所不同。目前认为吸收促进剂主要有三种作用机制，如表3所示。第一种是细胞旁途径，增加膜流动性，在细胞间隙打开紧密连接。如Kazutaka等人[49]研究环糊精及其衍生物对促*体生成激素释放激素大鼠鼻吸收的影响，发现促*体生成激素释放激素通过与二甲基-β-环糊精络合作用使鼻黏膜通透性改变，药物吸收增强，但组织形态学无变化；第二种是溶解黏膜，即破坏鼻黏膜结构。如Khandler等人[50]将1%聚氧乙烯-9-月桂基醚与IU·mL-1胰岛素大鼠鼻腔给药，发现胰岛素鼻吸收显著增强的同时伴随鼻上皮严重破坏以及细胞缺失；第三种就是降低粘液粘度和弹性，如Hagan等人[51]考察氯化棕榈酰肉碱对生物合成人生长激素在大鼠鼻腔吸收的影响，发现氯化棕榈酰肉碱对人生长激素的鼻吸收有一定促进作用，对鼻黏膜完整性不会产生影响。在考虑增强鼻腔吸收作用的同时，也要考虑长期给药的毒理学意义。许多吸收促进剂，特别是脂肪酸和非离子表面活性剂等，会改变膜的完整性，并可能永久性地损坏膜结构[28]。3.2酶抑制剂添加酶抑制剂以保护肽类药物免受酶降解也有助于鼻腔吸收。Morimoto等人[55]实验证明，甲磺酸卡莫他特作为一种氨肽酶和胰蛋白酶抑制剂能增加血管加压素和去氨加压素的大鼠鼻腔吸收。Hussain等人[56]研究发现经鼻给药的鲑降钙素会被胰蛋白酶降解，胰蛋白酶抑制剂的添加会增强鲑降钙素的鼻腔吸收。而且，酶抑制剂与吸收促进剂合用对药物的鼻腔吸收作用显著增强。如添加酶抑制剂（贝司汀和普罗霉素）和吸收促进剂（甘胆酸和二甲基-b-环糊精）可增加甲硫氨酸脑啡肽在离体鼻上皮的吸收[57]。3.3药物载体对于多肽药物来说，由于其本身容易被酶降解，设计药物载体系统可以保护多肽药物不被鼻腔环境提前破坏代谢，如脂质体、纳米粒、微球等给药载体均可用于鼻腔给药[58-63]。3.3.1脂质体脂质体是封闭的磷脂双层膜，内部具有亲水核心。脂溶性化合物可镶嵌在磷脂双层膜中，水溶性化合物被包裹于亲水部分，所以脂质体既可携载脂溶性药物又可携载水溶性药物。脂质体的理化性质和结构特点与细胞膜相似，可通过与细胞膜融合作用或内吞作用将药物送入细胞内部。Zheng等人[64]制备了H肽（鳖甲多肽提取物）鼻腔给药脂质体制剂。与经鼻腔给药的H溶液相比，H脂质体经鼻给药后，初始吸收速度较慢（tmax=30min），在血液中停留时间较长，生物利用度比H溶液高2.69倍。3.3.2纳米粒纳米粒是以高分子材料为载体，将药物包裹在其中制成的粒径为10～nm的载药微粒，具有靶向性、缓释性、稳定性好等特点。Li等人[65]开发出一种凝集素（Odorranalectin，OL）修饰的姜*素（Curcumin，Cur）纳米粒鼻腔给药系统，体外释放实验发现与游离姜*素相比，载姜*素的纳米粒在24h内的累积释放率低于40%，7天的累积释放率约为80%，具有明显的缓释作用。3.3.3微球微球制剂是目前研究最多的鼻用剂型，它有很强的生物黏附性，药物在鼻腔部位的滞留时间可延长至4h。此外，微球还能保护药物不受酶的代谢，因此可以在很大程度上提高药物的生物利用度。Wang等人[66]制备了载有胰岛素的氨基明胶微球，经健康大鼠鼻腔给药后，载有胰岛素的氨基明胶微球的释放明显慢于天然明胶微球，在30分钟内累积释放18.4%和32.4%，在8小时内累积释放56.9%和75.1%。产生此现象原因是微球的水凝胶性质，它可以从鼻黏膜吸收水分，从而导致上皮细胞膜暂时脱水和紧密连接的开放，而且氨基明胶微球的正电荷也明显有助于吸收增强效应。4
鼻脑传递
近年来，鼻腔给药系统除了探究如何提高药物在鼻腔内的吸收外，研究的重点趋向于鼻脑传递，给中枢神经系统疾病的治疗提供了一个美好的前景。文献报道[67-70]，嗅受体神经元从嗅上皮和轴突的表面延伸树突，穿过筛板进入大脑内的嗅球，多肽类药物可能通过嗅觉上皮和/或轴突运输扩散等通过鼻腔直接进入大脑。由于要达到鼻腔上部筛板这样较深的吸收位置，且血脑屏障区域较小，故对鼻喷药物装置提出较高要求。近年来，已经有大量的鼻腔喷雾装置的研究和开发来实现这一点[71-73]。如何确定药物通过鼻脑传递是目前鼻腔给药研究最具挑战的一个环节，如通过间接的方法监控脑代谢变化的放射成像，并对脑脊液中药物浓度的测量[74-75]。但这些并不能直接证明药物进入脑的整个途径，没有提供直接的鼻-脑运输的定量测量，也没有显示直接的透过血-脑屏障。最近，药代动力学模型被提出用于研究药物鼻脑传递的定量测定[76-77]，然而，将这种方法类比到人类身上是非常困难的。尽管可以对动物模型进行更为仔细的研究，但由于解剖上的差异，包括嗅觉和呼吸上皮的比例大不相同，它们通常对人类鼻生物利用度的预测很差。5
展望
基于蛋白多肽类药物自身的理化性质，鼻腔给药不仅能够克服口服给药的首过效应、注射给药的顺应性差等问题，而且具有脑靶向、低剂量高活性等优点。但吸收促进剂对药物鼻吸收的提升及生物利用度与纤毛毒性之间的矛盾，长期给药毒理性研究等问题仍然有待解决。于是筛选各种吸收促进剂，酶抑制剂以及药物载体设计找到药物与鼻腔环境的最佳共存方式是未来需要继续研究的问题，本文为以后的多肽药物鼻腔给药实验设计与产品提供一定的思路和方法。参考文献
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