简述
食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种侵袭性恶性肿瘤，在中国每年导致超过25万人死亡。大多数ESCC患者死于肿瘤转移引起的器官衰竭。据报道，转移性ESCC患者的5年生存率低于非转移性ESCC患者。因此，早期诊断ESCC对预后预测和临床治疗至关重要。不幸的是，由于缺乏有效的无创检测方法，食管鳞癌的早期诊断仍然具有挑战性。因此，开发新的敏感检测方法对该病的早期诊断至关重要。
为了阐明食管鳞癌的发病机制和寻找潜在的生物标志物，作者采用转录组与代谢组相结合的综合策略，系统研究食管鳞癌的发病机制。首先，从公共数据库中检索15例ESCC患者的肿瘤和癌旁非肿瘤组织样本的转录数据，并通过差异表达分析来鉴定失调基因。随后，进行了富集分析，以揭示受失调基因影响的代谢途径，其中酪氨酸途径被确定为目标。然后，通过靶向代谢组策略对转录研究中与上述15例中国ESCC患者背景相似的中国ESCC患者和健康对照组的酪氨酸途径的血清代谢物表达谱进行量化。最后，结合代谢组学和转录组学的变异建立了一个生物学模型来阐明ESCC患者的肿瘤发生和转移机制。
转录组数据与分析：从SRA数据库中检索15例中国ESCC患者肿瘤和邻近非肿瘤组织对样本的RNA测序数据，检索号为：SRR，SRR，SRR，SRR，SRR，SRR，SRR，SRR、SRR、SRR、SRR、SRR、，SRR、SRR、RR、SRR、SRR、SRR、SRR、SRR、SRR、SRR、RR、SRR、SRR、SRR、SRR、SRR、SRR和SRR。
血清样品的制备及LC-MS/MS分析：样品采用AgilentPoroshellEC-C18柱（50mm×3mm，2.7μm）以0.4mL/min的流速进行色谱分离。代谢物通过WatersAcquityUPLC系统（Waters，Milford，MA）与三重四级杆系统耦合进行分析。
代谢组学与转录组学数据的整合分析：对酪氨酸代谢途径相关基因进行基因集富集分析（GSEA），并与肿瘤组织和非肿瘤组织中表达幅度不同的所有人类基因进行比较。GSEA软件（版本3.0）通过次排列生成标准化富集分数和p值。与正常对照组相比，结合催化酶编码基因和酪氨酸途径代谢物的表达谱来解释肿瘤中一致的转录和代谢改变。
结果
1.食管鳞癌患者肿瘤组织与癌旁非肿瘤组织的转录组学改变
差异表达分析确定了个显著功能失调的基因，其中个基因上调，个基因下调（图1A）。图1B显示了前20个调控基因的表达谱。进行GO和KEGG途径富集分析以揭示这些功能失调基因的功能（图1B）。上调基因在以下功能和途径中高度富集：（1）细胞成分组织和定位；（2）刺激和应激反应；（3）细胞间和细胞内信号转导；（4）免疫过程；（5）DNA复制和代谢过程；（6）细胞周期（尤其是有丝分裂过程）。相反，下调的基因与以下功能和途径有关：（1）细胞形态发生和生物质量；（2）分解代谢过程和某些复合代谢过程（如脂肪酸、丙酸、苯丙氨酸、组氨酸）；（3）胞吐和外源代谢；（4）骨髓细胞活化参与免疫过程；（5）细胞死亡和自噬。这些结果表明，肿瘤的发生是细胞的一种额外刺激信号，影响细胞的正常形态发生，从而导致DNA复制、细胞周期、增殖和凋亡的紊乱。此外，肿瘤的发生影响细胞的系统免疫过程，干扰许多代谢产物的代谢，导致一些重要化合物的异常积累。
图1。食管鳞癌患者肿瘤组织与癌旁非肿瘤组织不同表达基因的火山图和热图。富集分析表明，ESCC的下调基因在某些代谢途径中富集，特别是苯丙氨酸-酪氨酸途径（苯丙氨酸是酪氨酸的生物合成前体，图3B）。在该研究中，选择苯丙氨酸-酪氨酸途径作为进一步研究的目标，作者对其相关基因进行了GSEA，旨在评价这些基因是否与肿瘤状态密切相关。在实践中，酪氨酸途径基因的表达谱与整个人类基因组的基因表达谱进行了比较，其中肿瘤和非肿瘤情况被指定为两种生物状态（图4）。结果，标准化富集分数（NES）为?1.64，FDRq值为0.，表明肿瘤组织中酪氨酸途径相关的基因较非肿瘤组织中的基因倾向于下调。这些结果证实酪氨酸途径相关基因与ESCC的发生发展密切相关，因此酪氨酸途径的代谢产物可能在ESCC的发生发展中起重要作用。
2.食管鳞癌患者与非癌对照组的代谢物表达谱比较
通过靶向代谢组学方法进一步探讨了食管鳞癌患者和非癌对照组酪氨酸途径中代谢物的表达。具体来说，9种代谢物，包括苯丙氨酸，4-羟基苯乳酸，3,4-二羟基苯丙氨酸，3,4-二羟基苯乙酸，酪氨酸，香草基扁桃酸，
图2。上调基因富集分析的气泡图。前20个富集项目（基于调整p值）分别为（A）GO生物过程和（B）KEGG途径。紫点的项目比绿点的项目更显著。
图3。下调基因富集分析的气泡图。前20个富集项目（基于调整p值）分别为（A）GO生物过程和（B）KEGG途径。紫点的项目比绿点的项目更显著。
图4。酪氨酸代谢基因的基因集富集分析。
高香草酸、多巴胺和去甲肾上腺素。然而，多巴胺和去甲肾上腺素的酪氨酸代谢途径由于其微弱的质谱信号没有得到进一步的评价。通过计算峰面积与相应内标物的比值，评估剩余7种代谢物的相对丰度。与健康对照组相比，七种代谢物在食管鳞癌和转移性食管鳞癌患者中的表达量均呈增加趋势。
随后，进行差异分析以揭示健康对照组、ESCC和mESCC患者中的特征性代谢物。值得注意的是，与健康对照组相比，ESCC和mESCC患者的四种代谢物（即PHE、HPLA、DOPA和DOPAC）表现出显著差异（p0.05）。
应用logistic回归分析预测食管鳞癌的诊断，建立诊断模型。对于无转移的患者，诊断模型为：P=exp.（Int+w1×PHE+w2×HPLA+w3×DOPA+w4×DOPAC）/[1+exp.（Int+w1×PHE+w2×HPLA+w3×DOPA+w4×DOPAC）]，其中P为ESCC发生概率，Int为模型截距，w1、w2、w3、w4为差异代谢物的权重。采用五交叉验证方法检验诊断模型的性能，选择敏感性、特异性和准确性作为性能指标。在五项交叉试验中，该模型的敏感性、特异性和准确性分别为0.、0.和0.。此外，受试者工作特性（ROC）曲线的曲线下面积（AUC）为0.。同时，也建立了有转移患者的诊断模型。模型定义为P=exp.（Int+w0×TYR+w1×PHE+w2×HPLA+w3×DOPA+w4）×DOPAC）/[1+经验（Int+w0×TYR+w1×PHE+w2×HPLA+w3×DOPA+w4×DOPAC）]。两种诊断模型都能在临床上正确区分ESCC和mESCC患者。作者也构建了一个基于不同代谢物对mESCC患者和ESCC患者进行分类的预后模型。预后模型定义为P=exp（Int+w0×TYR+w1×PHE）/[1+exp（Int+w0×TYR+w1×PHE）]。性能评价显示，该模型的敏感性、特异性、准确性和AUC值分别为0.、0.、0.和0.。总之，酪氨酸代谢途径中的代谢物可作为预测食管鳞癌发生和转移的潜在标志物。
图6。对食管鳞癌患者和健康对照者（A）基因和（B）酪氨酸代谢产物的主成分分析。
3.整合转录组和代谢组数据的生物学模型
图7。酪氨酸代谢过程的生物学模型。对于ESCC患者和健康对照组之间的比较，上下箭头表示代谢物的表达谱，而上下三角形表示基
因的特征。缩写：苯丙氨酸苯丙氨酸，苯丙酮酸PHP，酪胺TYA，酪氨酸TYR，3,4-二羟基苯丙氨酸多巴，多巴胺DA，去甲肾上腺素NE，
3-甲氧基-酪胺-3MT，3-甲氧基-4-羟基苯乙醛-MOPAL，3,4-二羟基苯乙醛-DOPAL，3,4-二羟基苯乙酸酯-DOPAC，高香草酸HVA。
对于酪氨酸途径的基因，作者通过主成分分析方法评估了它们区分肿瘤组织和正常组织的能力（图6A）。对于酪氨酸代谢的代谢物，我们还通过相同的方法检查了它们区分ESCC患者和健康对照组的能力（图6B）。结果表明，酪氨酸代谢相关的基因和代谢产物都能帮助正确识别肿瘤的发生和发展，提示这些基因和代谢产物在ESCC的发生发展中起着重要作用，酪氨酸代谢可能是ESCC发生发展的关键途径。因此，我们结合转录组学和代谢组学的数据，建立了酪氨酸代谢途径的生物学模型来解释潜在的机制（图7）。酪氨酸通过一些重要的化合物转化为高香草酸（HVA），包括3,4-二羟基苯丙氨酸（DOPA）、多巴胺（DA）、3-甲氧基酪胺（3MT）、3-甲氧基-4-羟基苯乙醛（MOPAL）、3,4-二羟基苯乙醛（DOPAL）、3,4-二羟基苯乙酸酯（DOPAC）。作者