青光眼是导致视力不可逆丧失的主要原因，全世界有超过万人受到青光眼的影响。房水(AH)循环障碍长期以来一直是青光眼的主要病理因素。因此，靶向AH流出是治疗青光眼的一种方法。然而，AH流出障碍的表观遗传学机制和靶向治疗仍有待开发。
目前，《MolecularTherapy》上的一篇文章中发现GDF7(生长分化因子7)低甲基化是AH流出障碍发生的关键。机制研究发现，GDF7启动子低甲基化是原发性开角型青光眼(POAG)产生和GDF7分泌增加的原因。过量的GDF7蛋白通过骨形态发生蛋白受体2型(BMPR2)/Smad信号转导，上调促纤维化基因、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤维连接蛋白(FN)，进而促进小梁网(TM)纤维化。
GDF7蛋白在青光眼TM(GTM)中形成正反馈环。这个正反馈环依赖于激活的TET(10-11易位)酶，该酶使GDF7启动子区域保持低甲基化。TM的表型转变增强了AH流出阻力，从而升高了眼压(IOP)，使神经纤维层变薄。机器学习模型也证实了这种甲基化依赖的机制，其特异性为84.38%，灵敏度为89.38%。
此外，在恒河猴身上，本文开发了GDF7中和疗法，以抑制TM纤维化和随后的AH流出阻力增加。中和疗法有效地控制了眼压(从21.3±0.3mmHg降至17.6±0.2mmHg)，AH流出速率也提高了3倍(从0.1mL/minmmHg增至0.3mL/minmmHg)，同时保护了视神经纤维。
这项研究为青光眼的表观遗传学机制提供了新的见解，并提出了一种创新性的GDF7中和疗法，作为一种有效的干预措施。
图1.CDF7启动子低甲基化导致AH流出阻力增加的信号通路示意图
首先，作者通过对8个正常人的TM和8个POAG患者的TM进行生物信息学分析，皮尔森相关系数显示这两组样品之间具有一致性。利用全基因组DNA甲基化微阵列寻找出个异常甲基化的基因和个CpG位点，并将前20个甲基化基因进行热图分析。最后，经过KEGG分析和亚硫酸盐测序(BSP)发现GDF7是一种很潜力的POAG调控因子。
随后，作者通过实时PCR分析，对90个GTM样本进行分析，检测了其GDF7的表达情况。结果显示，GTM中的GDF7的转录水平比NTM中的显著增加。此外，通过ELISA测定了GTM匀浆中的GDF7蛋白的表达情况；利用DAC(一种DNA甲基化转移酶抑制剂）和BSP实验证明了DAC处理过的TM中，其GDF7的转录水平增加。最后，作者分析了GDF7启动子的甲基化水平和临床表现即眼内压(IOP)升高、视神经纤维层(RNFL)厚度降低、杯盘比(CDR)增加、视野(YF)缺损之间的关系。其中，IOP与GDF7甲基化水平呈负相关，RNFL厚度与GDF7甲基化水平呈正相关，而CDR和YF缺损无明显关联。
图2.POAG中发现GDF7低甲基化起重要作用
接下来，作者通过对GTM中胶原蛋白的含量，促纤维化的标志物(α-SMA,FN,andColI）和NTM细胞的标志物N-神经钙粘素(N-cad)进行了免疫荧光分析，以此证明了过表达的GDF7蛋白促进了TM的纤维化。此外，作者还制备了nGDF7,一种GDF7的抗体，探究其能否降低促纤维化的标志物表达，升高N-cad。
图3.过表达的GDF7蛋白促进了TM的纤维化
TET双加氧酶可进行去甲基化修饰，为探究GDF7启动子去甲基化是否是TET依赖性的，作者利用二甲基草酰甘氨酸(DMOG)—一种TET酶抑制剂对NTM细胞进行处理，发现其对GDF7启动子甲基化没有影响，但是用DMOG处理GTM细胞后，发现其GDF7启动子的甲基化水平在4h时显著升高。结果表明，在青光眼中，活化的TET酶是维持GDF7启动子低甲基化状态所必需的，而不是NTM向GTM病理转化过程中DNA去甲基化的“始作俑者”。为了阐明GDF7启动子中甲基化水平降低如何促进GDF7基因的转录，作者用逆染色质免疫沉淀(ChIP)方法鉴定了与低甲基化的GDF7启动子结合的转录因子。采用液相色谱-质谱(LC-MS/MS)联用技术对反向芯片探针拉下的蛋白质进行分析。在GTM细胞中发现了三种转录因子与GDF7启动子结合：ETS1、Foxo1和KDM3A。定量PCR(QPCR)证实，与NC相比，GTM细胞中GDF7启动子第2区与ETS1的结合增强。然而，另外两个转录因子与青光眼和正常的GDF7启动子有相似的结合亲和力，这在病理情况下缺乏意义。为探讨ETS1与GDF7启动子的结合情况，将人ETS1质粒与荧光素酶报告基因GDF7启动子共转染到TM细胞中。在ETS1过表达的细胞中，荧光素酶活性增加。在ETS1瞬时敲除细胞中，荧光素酶活性受到抑制，表明ETS1可以直接与GDF7启动子结合，增强该基因转录。将NTM和GTM细胞的GDF7启动子第2区克隆到荧光素酶报告基因中，以了解其转录活性的变化。荧光素酶活性的增强证实了青光眼GDF7启动子转录活性的增强。这些结果表明ETS1可以与低甲基化的GDF7启动子结合，促进POAG患者的基因转录活性。DMOG处理对NTM细胞中ETS1与GDF7启动子的结合没有影响。然而，在GTM细胞中，ETS1和GDF7之间增加的结合可以被DMOG抑制。此外，检测了DMOG在GDF7转录调控中的作用。荧光素酶报告实验证实，与未处理的细胞相比，DMOG显著抑制了青光眼GDF7启动子的转录活性。作者进一步测试了TET在青光眼中GDF7的产生和分泌中的重要作用。GTM细胞培养上清液中GDF7分泌增加，DMOG可阻止青光眼诱导的GDF7过度表达，表明TET参与了GDF7的过度表达。图4.TET酶维持GDF7低甲基化促进转录
此外，作者还通过实验证明GDF7的表达是TET依赖的正反馈回路；GDF7通过BMPR2/SMAD1，-5和-9信号传导促进TM纤维化并在人工神经网络中得以验证；最后，GDF7中和即用nGDF7抗体对抗GDF7，有效抑制了恒河猴中的TM纤维化。文献来源：