项目名称：绘制细胞全转录组信使RNAm6A甲基化单碱基分辨率图谱
申报单位：高分子科学与工程学系
负责人：刘建钊
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项目简介
信使RNA甲基化N6-甲基腺嘌呤（m6A）是细胞内调控基因表达不可或缺的天然化学修饰。单碱基水平测定信使RNAm6A是研究其生物学功能的必要条件，我们利用代谢标记法成功绘制了哺乳动物细胞全转录组信使RNAm6A单碱基分辨率图谱。
TheN6-methyladenosine(m6A)isanaturallyoccurringmessengerRNA(mRNA)modificationandplaysanessentialroleincontrolofcellulargeneexpression.DeterminationofmRNAm6Amodificationsitesatsinglebaseresolutionisaprerequisiteforstudyingm6Abiologicalfunctions;weheretakeadvantageofmetaboliclabelingmethodtosuccessfullymapthetranscriptome-widemRNAm6Alocationsinmammaliancellsatsinglebaseresolution.
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研究团队
刘建钊，长聘教授，现任浙江大学高分子系生物医用大分子研究所副所长，生物大分子核酸化学与生物学课题组组长，同时任浙江大学生命科学研究院兼职教授。课题组主要研究兴趣为生物大分子RNA和DNA化学修饰及其生物学意义、核酸化学标记及核酸碱基化学修饰测序方法开发、荧光生物探针和生物成像等。
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科学解读
中学生物知识告诉我们，遗传物质核酸DNA和RNA分别由四种最基本的单元组成，统称为核苷酸。核苷酸单元由磷酸，五碳糖（DNA为脱氧核糖，RNA为核糖）和嘌呤及嘧啶碱基团构成。对于DNA而言，其序列由四种碱基组成，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T），而RNA则是将胸腺嘧啶替换为了尿嘧啶（U）。弗朗西斯·克里克提出了分子生物学的中心法则，DNA碱基序列编码遗传信息，遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质。
随着科技检测技术手段的进步，科学家发现细胞内DNA和RNA碱基或糖环等位置上存在着多种化学基团修饰，甲基化修饰最为典型。他们在细胞内分子层面上改变了核酸的状态，进而调控基因的表达，如DNA高度甲基化（m5C，5-甲基胞嘧啶）修饰能抑制其所在基因转录表达。从上个世纪70年代发现m5C以来，DNA甲基化修饰被科学家广泛深入研究，发现它在生物个体发育和生理疾病形成等过程扮演不可或缺的重要角色，是表观遗传学领域的重要研究内容，至今仍是前沿热点。这些成果的取得完全得益于DNA甲基化测序技术的发展，尤其是DNA甲基化测序金标准方法即m5C亚硫酸盐单碱基测序技术的成功开发，极大的推进了DNA甲基化功能研究。
信使RNA（mRNA）上也存在甲基化修饰如N6-甲基腺嘌呤（m6A），它是和DNA甲基化m5C（m5C/C,约2-5%）上世纪70年代发现的，但研究进展极为滞后，主要是因为m6A丰度相对较低，缺乏高灵敏度定量和测序表征手段。m6A修饰是哺乳动物细胞mRNA内部丰度最高的碱基化学修饰(m6A/A约0.3-0.5%，平均每条mRNA上含3到5个m6A),从本世纪10年代才复苏并蓬勃发展，迄今为止发现m6A近乎影响细胞内mRNA代谢寿命过程中的每一个环节，包括加工剪接、降解、翻译和运输等，它是细胞内一个不可或缺的转录后基因表达调控机制，和DNA甲基化的基因转录调控机制形成辉映。
如同DNA甲基化领域发展的驱动力一样，mRNAm6A甲基化研究领域成果的取得也是得益于其检测和测序技术的发展。全转录组mRNAm6A的测序能告知哪个mRNA上含有甲基化修饰，为功能研究提供重要基础。目前，m6A测序技术主要基于年发表的m6A抗体免疫沉淀结合高通量测序技术(m6A-seq或称MeRIP-seq)，该方法通过将长链mRNA打碎成-个核苷酸的片段，再利用m6A抗体将含有m6A的RNA片段进行富集，从而将m6A定位到RNA上的不同区域。该方法可以得到全转录组m6A分布的谱图，只能定位m6A在RNA上-核苷酸长度范围内，并不能以单碱基分辨率对m6A进行鉴定。
领域内先后探索了一些RNAm6A单碱基或近乎单碱基分辨率的测序方法。例如，抗体与RNA光交联方法能引起m6A位点附近的交联位点发生碱基突变，或者利用m6A结合蛋白融合碱基编辑蛋白，使其与m6A结合时编辑附近碱基，从而导致m6A位点附近发生碱基突变。但是，这些方法都无法对m6A直接定位，而是通过突变位点间接定位其附近腺嘌呤为m6A，会产生较大误差，对m6A簇的鉴定较为困难。基于RNAm6A甲基敏感的核酸内切酶方法也有报道，但是只适用于单一甲基化序列，不具有普适性。
为了解决领域内的科学难题，我们课题组开发了一种名为m6A-label-seq的高通量测序方法，实现全转录组RNAm6A位点单碱基分辨率测定。m6A上的甲基是通过细胞内生物化学反应得到的，难以进行修饰和辨认，具有化学惰性。我们思考能否人为介入这一过程，利用细胞天然的RNAm6A甲基化代谢进程，通过改造细胞内甲基供体，将甲基替换为化学活性的烯丙基，这样烯丙基供体在细胞内甲基转移酶的作用下，修饰腺嘌呤得到N6-烯丙基腺嘌呤（a6A），替代了原本的m6A。最终，烯丙基可作为把手为其进行化学后修饰并单碱基分辨率鉴定该位点提供了机会。
我们利用上述想法，创造性的开发了RNAa6A定点突变识别高通量测序方法（如前面项目特色处所描述），成功绘制了人和鼠细胞全转录组mRNAm6A位点的单碱基分辨率图谱。并且，我们还利用多种生物正交的方法验证了检测到的m6A位点，证明了我们方法的可靠性。我们建立的m6A位点数据库，为研究m6A对调控RNA的功能以及各类癌症疾病形成的影响打下了坚实的基础。自然集团杂志NatureReviewsGenetics为该工作做了专题报道（Clyde,D.Nat.Rev.Genet.,21,）。
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