作者：王晓蔷张佳慧宁含含
近年研究表明，DNA去甲基化药物（HMAs）-DAC等可降低抑癌基因甲基化程度，因此可治疗solidcancers。除此之外，HMAs通过病毒拟态（viralmimicry）诱导抗肿瘤免疫。Viralmimicry特点为上调重复元件水平和形成免疫源性dsRNA，进而激活endogenousviraldefensepathways和I/III型干扰素效应。已有研究表明viraldefense与ICB（immunecheckpointblockade）疗效正相关，并且多项研究证实HMAs与ICB有协同作用，但HMAs（剂量尤甚）对免疫细胞影响研究尚少。因此，DanielD.DeCarvalho等人于年2月在线发表在MolecularCell期刊“DNAhypomethylatingagentsincreaseactivationandcytolyticactivityofCD8+Tcells”。
首先发现低剂量DAC可增加小鼠肿瘤内CD8+T浸润和杀伤功能以抑制肿瘤生长。研究使用3组-vehicle、DAC和DAC+α-CD8发现α-CD8抵消DAC增强的CD8+T募集作用、抑制的肿瘤体积，且DAC加强CD8+T的TNF、IFN-γ和GzmB分泌。以上提示DAC依赖CD8+T发挥抗肿瘤疗效。
接着将健康人体内分离的CD8+T进行以下四种处理：未激活、CD3/28激活、nMDAC、nMDAC。CellTraceVioletdilution结果示DAC减慢T细胞增殖速率和减少T细胞数目。FCA结果示DCA显著上调T细胞激活marker（CD25、CD69、HLA-DR）和抑制分子（PD1和LAG3）。以上提示，HMAs可激活人CD8+T免疫功能。
之后为进一步说明HAMs对人CD8+T杀伤作用，首先发现DAC可增加人CD8+T分泌IFN-γ、TNF和GZMB，因此推测DAC可增强CD8+T杀伤功能。所以接着使用DAC激活人CD8+T（HER2-CD3激活抗体培养后，可杀死HER2+的肿瘤细胞）与CFSE标记乳腺癌细胞（研究使用两种HER2+细胞系-MCF10-HER2和PDX）共孵育，结果示CFSE+乳腺癌细胞数目明显减少，且CD8+T的CD25上调。另外使用OT-1小鼠的CD8+T与OVA+肿瘤细胞共孵育，方法同上且结果相似。之后又将OVA+CFSE+肿瘤细胞接种到已经对OVA免疫小鼠，之后评估T细胞杀伤功能发现HAMs增强T细胞体内杀伤作用。此外本研究收集人外周血CD8+T发现，DAC增强GZMB和perforin分泌。以上结果说明,临床用量的HMA可改善小鼠和人类CD8+T细胞杀伤功能。
研究第二部分首先使用亚硫酸盐测序（RRBS）评估DNA甲基化变化和ATAC-seq评估染色质可及性。首先RRBS结果示，DAC降低stimulatedCD8+T的CpG岛甲基化程度。接着总结数据（0bptilingWindows和q≤0.05）发现，DAC处理的stimulatedCD8+T在minimum区减少了19.1%。HOMERmotif富集分析发现MEF2家族基因的转录因子明显富集。之后ATAC-seq结果示，激活的CD8+T的NFRs（nucleosome-freeregions，）增加，而DAC的NFRs有所回落，但NFRs宽度增加。为探究DAC直接影响的染色质区域，首先根据三种状态T细胞的overlap区发现，与unstimulated相比，stimulate的CD8+T增加了个NFRs，而个NFRs在stimulated+DAC的CD8+T且不在stimulate的CD8+T，这说明CD8+T激活时染色质可及性显著增加，而在此基础上，DAC又影响其中特定的染色质位点。HOMER富集分析显示，中的个位点会富集转录因子ATF3,FRA1,AP-1,JUNB,BATF,FRA2,andFOSL2。
因为DAC影响MEF2和AP-1复合体，所以接下来比较unstimulatedTcells,stimulatedTcells,andstimulated+DAC的转录组数据，GO富集分析显示前1%通路大多与有丝分裂和T细胞激活有关（TableS4）。值得注意的是，calcineurin-regulatedNFAT-dependenttranscriptioninlymphocytes’’和‘‘calciumsignalingintheCD4+TCRpathway’’明显变化，根据已有研究显示钙离子对T细胞激活十分重要，因此评估了三种处理下T细胞的钙离子，发现DAC剂量与T细胞内钙离子浓度呈正相关。以上数据和已有研究均提示NFATc1在CD8+T激活中的重要作用。NAATc1转录本包括长短不同的11个转录本，其中短转录本、、属于短转录本。本研究RNA-seq数据显示，DAC组的NFATC1-和NFATC1-转录本水平明显增高。WB证明，DAC组内仅NFATC1/A蛋白的短异构体表达。
因此聚焦于DAC通过calcium-calcineurin-NFAT增强CD8+T杀伤作用。使用CsA（calcineurin抑制剂）证实DAC上调calcium-calcineurin-NFAT以增加CD8+T杀伤功能。
为解析DAC调控NFATC1短转录本机制，根据短转录本的9号外显子3‘UTR的PAS1聚腺苷酸化，不发生在长转录本11号外显子3‘UTR的PAS2，将RNA-seq数据进行poly-A分析，发现短转录本3‘UTR明显增加而长转录本3‘UTR明显降低，提示其发生可能与PAS1下游（基因内部）的CpG甲基化降低有关。以上结果说明DAC促进PAS1表达，导致NFATC1转录本转录翻译增加。
最后使用CyTOF分析人CD8+T发现，激活的CD8+T存在高度表型异质性，DAC只主要影响Cluster3,10,15,23,和24。进一步分析发现Cluster15为granzymeBhigh,perforinhigh。因此DAC主要影响granzymeBhigh,perforinhighCD8+T。
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