[背景简介]
柔性聚合物纳米载体常用于体内药物的控释和靶向递送治疗。通过工程化技术修饰纳米载体表面特性来增强疗性，以促进与目标细胞群的相互作用，同时避免单核吞噬细胞系统(MPS)的摄取和清除。由此可见，开发纳米载体的第一步是为其设计适合材料表面化学以获得理想的表面性能。在体内，细胞不会直接与裸露的材料表面相互作用，纳米载体表面吸附血浆蛋白形成蛋白冠结构，而降低蛋白质吸附量和调节吸附蛋白冠的组成是提高纳米载体性能的两种常用方法。一种策略是使用亲水和惰性聚合物涂层(PEG)修饰纳米载体表面，以最大程度地减少蛋白质吸附。已证明PEG修饰有助于纳米载体逃避先天免疫系统吞噬细胞(最主要是巨噬细胞(MΦ))的识别，从而延长了纳米载体的体内循环时间。对于静脉注射的纳米载体，血清白蛋白通常占蛋白冠的很大部分，因为它是血液中含量最高的蛋白质。其结果不仅取决于该蛋白质在冠中是否存在，还取决于该蛋白质在吸附状态下的三维构象。许多纳米材料可以调节吸附蛋白的结构，但在评价纳米材料性能时往往忽略了吸附蛋白折叠状态所起的作用。本文作者利用由聚乙二醇-b-聚(丙烯硫醚)(PEG-b-PPS)二嵌段共聚物自组装而成的聚合物囊泡(PSs)作为模型纳米载体，探究蛋白冠与免疫细胞亚群的相互作用。
1.PEG-b-PPS的自组装及其物理化学表征
将功能基团：甲氧基(MeO，-OCH3)，羟基(OH,-OH)以及磷酸盐(Phos,-PO4)接到PEG的结构上(图1a)。PEG快速纳米沉淀自组装形成纳米囊泡。低温透射电子显微镜观察PEG-b-PPS疏水层将内部亲水腔与外部PEG隔开(图1b)。小角度X射线散射(SAXS)对其进行了球形结构表征(图1c)。PhosPS(图1d)、OHPS(图1e)、MeOPS(图1f)的散射剖面均适用球形囊泡模型。拟合的直径和DLS(动态光散射)测定的直径一致(表1)。PhosPS的负表面电荷比OHPS和MeOPS更大，这是其pKa上的差异所导致的(图1g)。右旋糖苷-四甲基罗丹明(Dex-TMR)作为亲水性模型药物封装进囊泡内证明内水腔的存在(图1h,i)。Dex-TMR的加入没有使PS直径或电动势有很大的改变。对于所有PS囊泡，其包封率为30–36%(图1i)。总之，PhosPS，OHPS和MeOPS理化特性表明，这些PS是的表面化学，电荷和粒径大小是不一样的。
图1.聚乙二醇-b-聚苯硫醚聚合体形态及亲水负载表征
表1.PEG-b-PPS聚合体的理化特性
2.MΦ种群对PS表面化学敏感
将载有近红外染料(DiR)和PBS的PS静脉注入C57BL/6J小鼠(4个治疗组)，4小时后采集器官，以评估早期生物分布差异(图2a)。4小时后，血液中检测到各类型PS的水平相当(图2b)。且在4小时的时间点，每种制剂中超过55%的PS已从血液中清除(图2b)。其组织脾、肝、肾和肺的分布实验发现脾和肝中的吞噬细胞清除了大量PS(图2d-f)。与OHPS和MeOPS相比，肾脏对PhosPS纳米载体的吸收明显减少(图2d,g)。器官水平分布的结果提出了一个问题，即不同的免疫细胞亚群，特别是MΦ，是否对PS表面化学敏感。为了进一步研究这一点，作者制备了每个解剖器官的单细胞悬液，并对一整套免疫细胞(CD45+)以及合并的CD45-细胞群体对PS摄取进行了流式细胞术分析。
在脾中，作者评估了两个MΦ群体、树突状细胞(DCs)、两个单核细胞群体以及中性粒细胞和嗜酸性粒细胞对PS的摄取。树突状细胞对MeOPS的摄取较高(图2i)。与PhosPS和OHPS相比，CDF4/80+MΦ对MeOPS的摄取较小(图2i)。与PhosPS相比，CD+MΦ对MeOPS和OHPS的摄取较高(图2i)。肝脏MΦ/K和单核细胞对表面化学差异敏感(图2j)。与中性PS相比，肝脏MΦ/K和单核细胞对PhosPS的摄取较高。淋巴结中，MCMΦ细胞对PhosPS表现出较强的摄取(图2k)。在肺部中，研究11种肺细胞类型，7种对PS表面化学敏感。这7个细胞群体中有5个对OHPS表现出强摄取(图2l)。炎性单核细胞(Mono(Ly-6Chi))对OHPS最敏感(图2l)。最后，对肾脏中4个细胞亚群的PS摄取进行了检测。只有肾脏MΦ对PS表面化学敏感(图2m)。
综上，MΦ对PS表面化学特别敏感(图2n)。由于将PS引入富含蛋白质的血液中会使蛋白质快速吸附，因此认为免疫细胞摄取的差异可能是由于蛋白冠的调节及其对细胞相互作用的影响，而不是由于裸露的表面差异所致。因此作者专门评估了血清白蛋白吸附增加MΦ摄取中的作用。
图2.小鼠巨噬细胞群体对体内多聚体表面化学反应敏感
3.吸附的白蛋白增加了MΦ对PS的摄取
血清蛋白吸附到每一种囊泡形成蛋白冠。体内研究表明，在IV给药4小时后，每种PS超过50%已从血液中清除。因此，作者研究了一个更早的时间点2小时，这既与这些早期清除事件有关，也允许形成一个相当稳定的蛋白冠。为了测定吸附白蛋白对MΦ摄取PS的影响，作者使用纯化的白蛋白形成了蛋白冠(图3a)。白蛋白是一种心形转运蛋白，由三个结构域组成，并在生理pH值下带有负电荷(图3b)。为了评估PS对白蛋白的吸附是否随着白蛋白浓度增加而增加，以及表面化学是否对吸附蛋白水平有显著影响，将PS与BSA浓度系列(0-10mg/mL)孵育。白蛋白对PS的吸附呈浓度依赖性增加。MeOPS总BSA吸附量最低(图3c)。
蛋白质在纳米载体表面的吸附会导致电荷屏蔽，从而改变纳米载体与生理环境的静电相互作用。因此，作者研究了白蛋白吸附与PS表面zeta电位变化之间的关系。BSA对PhosPS的吸附导致了显著的浓度依赖性的表面电荷大小的降低(图3d)。这种电荷随吸附白蛋白浓度的增加而降低，符合简单的单相结合模型(r2=0.89,Fig3e)。与PhosPS相比，白蛋白吸附对OHPS和MeOPS电荷的影响要小得多(图3d,e)。
接下来，作者评估了白蛋白吸附是否改变MΦ对PS的吸收(图3f-h)以及观察到的细胞摄取变化是否与静电变化相关。由于大多数细胞表面具有负电荷，由于静电斥力的作用，细胞对阴离子和中性纳米粒的吸收速率通常低于阳离子纳米粒。为了检测纳米载体的细胞摄取，作者将MΦ与载有DEX-TMR的纳米载体孵育2小时，用PBS洗涤细胞，并使用流式细胞术测量纳米载体的荧光强度。
对吸附介导的静电变化的分析表明，白蛋白对PhosPS的外部电荷影响最大。因此，作者假设白蛋白吸附将对MΦ吸收PhosPS的速率产生最大影响。为了验证这一假设，作者在将PS与浓度升高的白蛋白预孵育后，测定了无血清条件下MΦ对PS纳米载体的摄取速率(图3f)。在大多数情况下，白蛋白的预吸附会增加PS的细胞摄取(图3g,h)。用10mg/mL白蛋白预孵育的PhosPS观察到最大的摄取(图3g,h)，其相应的电荷大小从-59.3±2.8mV降低到-39.1±3.2mV。这些结果表明，蛋白冠使PhosPS的负电荷减少，降低了其与细胞膜的静电排斥力，从而增加了摄取(图3g,h)。但是静电因素不能解释吸附后OHPS和MeOPS的MΦ摄取的变化，因为白蛋白吸附后这些纳米载体的Zeta电位变化很小(图3d）。
综上，这些结果表明，白蛋白的吸附增加了MΦ对PS的吸收。只有在PhosPS-BSA配合物中发现了静电对这一结果的影响。
图3.吸附的白蛋白增加了所有三种PS表面化学物质对巨噬细胞的吸收
4.聚合物表面化学调节吸附的白蛋白的三维构象
驻留在组织中的MΦ表达高水平的SR-A1，并且已报道白蛋白的结构修饰形式是这些受体的非规范配体。作者推断，如果PS表面化学能稳定或变性蛋白冠中的白蛋白，那么MΦ可能利用SR-A1来感知PS表面的这些特征。因此，作者结合生物物理和生物化学技术对吸附介导的白蛋白三维结构变化进行了表征(图4)。白蛋白主要由α-螺旋二级结构元素组成。
色氨酸(Trp)猝灭法检测MeO、OH或PhosPS表面吸附的白蛋白是否展开(图4a)。该实验的原理是，天然折叠蛋白的内在荧光在变性剂存在时减弱。根据这一原理，随着变性剂盐酸胍(Gdn-HCl)浓度的增加，可以区分不同水平的白蛋白展开(图4b)。OHPS吸附后荧光蛋白显著降低，而PhosPS或MeOPS表面吸附后荧光蛋白变化无统计学意义(图4c)。说明OHPS能使吸附的白蛋白变性。
白蛋白，在其天然折叠状态下不容易被胰蛋白酶水解，而变性形式的蛋白质则更容易被蛋白酶裂解。在2h的过程中，在多个时间点用甲酸使白蛋白水解(图4d)。通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS；图4e,f)测量了对照白蛋白时间依赖性的蛋白水解。对于每种PS，将归一化峰面积拟合一相衰减模型(图4f)。游离白蛋白的表观蛋白水解速率(约0.09min-10比吸附到OHPS(约0.31min-1)和MeOPS(约0.15min-1)上的蛋白水解速率要慢得多。观察到吸附在OHPS和MeOPS上的白蛋白的加速水解，进一步表明白蛋白在吸附到这些表面时会部分展开，并且羟基化(OH)比甲氧基(MeO)表面更容易使白蛋白变性(图4f)。另一方面，与游离白蛋白(图4f)相比，白蛋白在PhosPS上的吸附导致了较慢的蛋白水解速率(~0.02min?1)，这与白蛋白在PhosPS表面吸附后保持其折叠状态一致。
总的来说，蛋白水解结果与色氨酸淬灭结果一致。然而，这些分析仅仅表明吸附后的整体结构发生了变化。为了对吸附介导的蛋白质二级结构变化进行更详细的说明，作者采用圆二色谱(CD)来评估蛋白冠中α-螺旋的含量变化。蛋白分子的CD谱分别在nm和nm处具有双负峰形，这是典型的α-螺旋结构。CD光谱法证实OHPS使白蛋白的变性程度超过了10min85°C的热变性(图4h)，并且α-螺旋度显著降低。MeOPS使白蛋白变性程度较小，而PhosPS则使白蛋白的α-螺旋度略有增加(图4i)。
蛋白酶敏感性与色氨酸荧光(图4j，左)和α-螺旋度(图4j，中)负相关。OHPS使白蛋白变性最强，因此，Trp荧光和α-螺旋含量最低(图4j)。PhosPS观察到相反的情况，它极大地稳定了白蛋白的折叠状态(图4j)。尽管α螺旋度随Trp荧光的增加而增加，但正相关性不显著(图4j，右)。
为了进一步研究吸附到每种PS类型后白蛋白结构的构象变化，作者使用同步加速器辐射对PS-BSA复合物进行了SAXS。将BSA吸附到PhosPS，OHPS和MeOPS的表面，并评估高强度10keVX射线散射的差异。
为了评估白蛋白的吸附是否会改变其表观柔韧性或对称性，作者将Kratke图转换为通过Guinier估计的回转半径(Rg)归一化的无量纲形式(图4k)。在该图中，在√3处出现一个峰。偏离此波形表示不对称或无柔韧性。化学变性的白蛋白(对照)表现出与曲线形状，峰和大小的强烈偏离，而吸附到PS表面上的白蛋白的峰位于√3。在这项研究中，PS–BSA并未出现与峰值的明显偏离，而是在波形的尾部区域出现了偏离。该观察结果表明所有三种PS的白蛋白的固有柔韧性和对称性基本上没有改变。
综上，这些数据表明白蛋白的结构受PhosPS表面的干扰最少，并且可以稳定白蛋白的折叠。吸附到MeOPS和OHPS表面后，白蛋白部分展开。且OHPS导致白蛋白二级结构的损失最大。
图4.聚合物表面化学调节吸附的白蛋白的构象
5.MΦSR-A1受体识别PS表面的变性白蛋白，但不识别稳定的白蛋白
上述结果表明PhosPS保留了白蛋白的折叠状态，而OHPS则使白蛋白部分变性。MeOPS表面对白蛋白结构的影响尚不明确。然而，Trp分析和CD光谱的结果表明白蛋白部分展开并且二级结构减少。因此，作者假设MΦSR-A1可以识别变性白蛋白的PS表面(OHPS和MeOPS)，而稳定白蛋白的表面(PhosPS)可以逃避SR-A1的识别。
为了检验这些假设，作者将白蛋白预先吸附在三种PS化学表面上，并用1×PBS(阴性对照)或饱和浓度的清道夫受体竞争剂岩藻依聚糖(2.5mg/mL)(图5a)。岩藻依聚糖是一种衍生自褐藻的硫酸化多糖，它与SR-A1高特异性结合。在MΦ高表达SR-A1(图5b)。此外，在摄取研究过程中，这些高岩藻依聚糖浓度不会影响细胞表面SR-A1的水平(图5c)。
用岩藻依聚糖预处理MΦ(图5a)可提高每种表面化学物质对原始PS的吸收(图5d)。岩藻依聚糖在无血清条件下增强原始聚合物纳米载体吸收的机制尚不清楚，但作者猜测是由于岩藻依聚糖的高分子量(MW)和受体紧密结合所致，从而增强了受体的簇集或相关现象。为了研究SR-A1是否有助于MΦ对PS-BSA复合物的识别和摄取，作者将PS-BSA预孵育于无血清培养基中(图5e)。OHPS-BSA和MeOPS-BSA处理细胞的中荧光强度(MFI)在岩藻糖胶预处理后下降(图5f)。OHPS的情况下，MFI的降低与对照组有显著差异(图5f)。PhosPS-BSA与OHPS-BSA或MeOPS-BSA相比，MFI的百分比变化显著不同(图5g)。在这些情况下，褐藻糖胶对PhosPS-BSA的吸收作用与OHPS-BSA或MeOPS-BSA相反，这与SR-A1识别表面展开被吸附白蛋白的纳米载体的作用一致。因此，作者推测，SR-A1不识别PhosPS-BSA复合物，而PhosPS保存被吸附的白蛋白结构是其逃逸SR-A1识别的原因。
图5.SR-A1能识别多聚体表面变性白蛋白
[总结]
SR-A1能识别OHPS-BSA和MeOPSBSA-蛋白复合物，而PhosPS-BSA-蛋白复合物由于其稳定白蛋白结构而避免了SR-A1的识别。本文为设计高性能纳米载体提供了合理化设计原则，可以利用此原理来调节SR-A1表达细胞对PEG化的柔性纳米载体的摄取，以用于靶向药物递送和免疫调节的多种应用。
文章来源：Vincent,M.P.,etal.,Surfacechemistry-mediatedmodulationofadsorbedalbuminfoldingstatespecifiesnanocarrierclearancebydistinctmacrophagesubsets.NatureCommunications,.
DOI:10./s--8
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