该论文的题目是“FrequencyandPhenotypicSpectrumofKMT2BDystoniainChildhood:ASingle-CenterCohortStudy（儿童肌张力障碍中KMT2B的突变频率和表型谱：单中心队列研究）”，发表于年。
之所以解析这篇论文，是因为这篇论文有以下特点：
实验研究简单，只是做了外显子测序；
研究靶标KMT2B基因“老旧”；
样本量也不大，有基因突变病例仅14例；
但是，研究者将这项研究发表于8分以上杂志。
我们一起学习，作者是怎么做到的。
一，研究背景（立项依据）
肌张力障碍（Dystonia）是主动肌与拮抗肌收缩不协调或过度收缩引起的以肌张力异常的动作和姿势为特征的运动障碍综合征，具有不自主性和持续性的特点，且在个体间存在明显的异质性。
自DYT1（TOR1A）发现以来，与肌张力障碍相关的多个基因得到鉴定。然而，仍有许多儿童和成人患者即使经过全面的遗传分析，其肌张力障碍依旧没有明确的基因诊断结果。
年，两个研究小组独立地确定了KMT2B的显性突变是儿童期普遍性肌张力障碍的“新晋”病因KMT2B编码一种特异性的赖氨酸甲基转移酶，能够催化甲基转移至组蛋白H3的第四赖氨酸（H3K4），这是一种重要的翻译后机制，可促进基因转录和表达，在正常人的发育中起关键作用。
然而，截至目前，尚未系统评估儿童期发病的肌张力障碍中KMT2B突变的频率，并且对该表型谱和疾病自然史的描述仍然有限。
因而，这篇文章目的在于确定发病年龄18岁的肌张力障碍患者队列中KMT2B突变的频率，相关的临床和放射学表型以及疾病的自然病史。
二，论文设计图
三，研究方法1，研究对象本研究纳入65例患有儿童期肌张力障碍发病的受试者（30名女性，35名男性），随访时间约30年。所有患者均为白人（意大利人），但1名患者是欧洲裔的委内瑞拉人。纳入标准为：（1）肌张力障碍在18岁之前发作；（2）排除肌张力障碍的继发原因（颅脑外伤，多巴胺受体阻断药治疗或代谢原因）；（3）已知的与肌张力障碍相关的基因未发生突变。2，基因分析根据标准程序从外周血白细胞中提取DNA，通过全外显子测序（whole-exomesequencing,WES）分析52例患者。在儿童发作性肌张力障碍中鉴别KMT2B之后，作者将该基因纳入针对运动障碍的定制基因组合中，对另外13名患者进行KMT2B突变筛查。3，计算机建模（InSilicoModeling）通过计算机模拟可以更好地表征KMT2B的某些错义突变是否对其结构和功能存在潜在致病作用（利用Pfam数据库，HHpred，MODELLER等，生物信息专业领域相关，可作为了解）。四，研究结果1，KMT2B变体的基因表征如表1和图1所示，已列举出本研究所鉴定的基因组KMT2B突变情况，且显示出它们在蛋白结构中的位置。这些突变均未在gnomAD中报告（截止于年8月），且14个中有12个是新突变。表1，本研究鉴定的KMT2B突变图1，本研究中鉴定的KMT2B突变在蛋白质结构中的分布。在文章的这一部分，作者对患者的全外显子测序鉴定出的KMT2B突变，结合计算机模拟完成具体分析：例如，3名患者携带移码突变，导致过早的终止密码子和蛋白被截短；9名患者携带KMT2B错义突变；九个变体中的八个变体的CADDPhred得分均大于23，支持存在负面作用；通过计算机模拟，预测p.AlaVal将影响PHD-like蛋白区域的正确折叠，从而使KMT2B的整体结构不稳定；此外，p.ArgGln变体影响位于KMT2B的CXXC锌指结构域中的高度保守的精氨酸，并被认为具有致病性等。作者对这些新鉴定的突变进行逐一分析，并绘制部分携带突变的患者家系图谱（见图2），在此不多做赘述，可以效仿文中的分析模式。图2，携带KMT2B变体的患者家谱2，计算机模拟（这部分内容主要涉及生物信息和分子生物学专业领域，临床医生可以作为了解，主要参考本文作者的研究思路）。根据Pfam域分配，KMT2B具有CXXC锌指结构域，其后是多个PHD/PHD类结构域和FYRN结构域。FYRC区和SET催化域位于C端，KMT2B的FYRN（富含F/Y的N末端）和FYRC结构域（残基-和-）在组蛋白H3K4甲基转移酶中特别常见，尤其是在包括混合谱系白血病（MLL）的蛋白质家族中。在对KMT2B蛋白结构完成分析后，作者进一步的模拟上述突变是否能够影响KMT2B蛋白结构及功能。例如，p.LeuPro预计会导致涉及Leu的疏水相互作用丧失；Arg与FYRN-FYRC复合物中的Asp形成盐桥，还参与稳定FYRN域中β片的骨架氢键；Ser与Thr形成氢键，而Glu与Ala的主链形成氢键，破坏这两个相互作用可能会使该结构域和整个蛋白质的折叠不稳定。图3，KMT2B突变对蛋白结构功能属性的预测影响3，KMT2B突变型携带者的临床特征作者在65例患者中鉴定出14例携带有KMT2B突变（21.5％；8例女性，6例男性），根据现有证据预测其中13例具有致病性，因此总体突变频率为20％；肌张力障碍发作的中位年龄为6岁（范围3–13），检查的中位年龄为23岁（范围10-52），中位疾病持续时间为18岁（范围3-42），且这些患者均无肌张力障碍家族史的报道。随后，作者对这些患者的临床特征进行描述，概括如下：（1）肌张力症状检测：14例患者中有11例（78.5％）的下肢是肌张力障碍发作的部位，表现为脚内翻，足底屈曲异常或脚尖走路；外展型或内收型类型的喉肌张力障碍在病程中的14例中有11例（78.5％）变得很明显，4例患者的语音几乎难以理解甚至完全失语；14例患者中有8例发生颌下肌张力障碍（57％），伴有下颌不稳和下颌张开减少，从而使言语质量下降；在某些患者中，发烧，感染，情绪紧张或月经来潮导致了持续数小时至数天的肌张力障碍恶化等。（2）其他神经系统症状检测：包括1例颈部和上肢肌阵挛，2例轻度睑睑下垂，2例小头畸形和1例非对称性强直震颤麻痹，肌肉力量正常的下肢出现锥体束征相对频繁（14例中有6例；43％）。（3）心理测评：作者对13名患者进行“韦氏儿童智力量表-修订版或瑞文推理测验”，轻度智力障碍被诊断为6例，而3例患者的智力水平较低（IQ≤77）。随访期间，无论是临床还是通过正式测试，均未记录到认知能力下降。（4）体格特征：一半以上的KMT2B突变携带者出现身材矮小。身材矮小定义为低于预期遗传目标的高度，该高度是根据父母的身高或同性别和同龄人的平均身高低于平均标准差≥2个标准差计算得出的。14例患者中有9例（64％）观察到轻微的面部畸形，包括球根鼻尖，低位耳朵，上唇薄，睑缘轻度上睑下垂，鼻梁宽和面部拉长。（5）影像学特征：所有处于不同疾病阶段的患者均进行了脑部MRI检查，未见异常。特别是，基底节在所有患中均显示正常信号（包括弥散加权图像和药敏加权图像）。仅1例患者观察到小脑蚓体轻度发育不全。表2.携带KMT2B基因突变患者的临床特点
4，药理治疗和DBS功效最后，作者对患者接受过治疗情况进行总结分析，这一部分各位临床医生可以参考写作思路，在此不一一罗列。所有患者均接受三联苯哌啶基，苯并二氮杂卓，巴氯芬，左旋多巴和匹莫齐德的不同组合治疗，并具有多种临床反应。在某些情况下，高剂量的三己基哌啶（30–40mg/天）可产生轻至中度的临床改善。在大多数患者中，三苯并吡啶基和氯硝西泮的组合是最有效的药理策略。八名对多种抗张力药物不满意的患者接受了针对内苍白球体感部分的立体定向双侧DBS。考虑到所有患者均在发现KMT2B之前接受过手术，因此术前进行Burke-Fahn-Marsden肌张力障碍运动量表时，临床医生对患者的遗传状况视而不见。在最后一次随访中，BFMDRS-M评分的中位数下降率为38.5％（范围81-2.4）。在移除植入物之前，其中一位患者也显示出DBS后肌张力障碍的实质性改善，还有一位患者在最初的DBS手术后3年内经历了肌张力障碍的明显改善（BFMDRS–62％）。五，结果讨论在这项研究中，作者筛选除65名患有儿童期肌张力障碍且遗传学改变未明确定义的患者，鉴定KMT2B和其他与肌张力障碍相关基因的致病性突变，并确定相对患病率，携带KMT2B突变患者的临床特征以及这一突变与预后的潜在关系。这项研究的优势在于：（1）新发现了12个基因突变。在这篇文章之前，已有47种KMT2B变体被报道，而在这项研究中，报告的KMT2B变体数量增加到61个，且有12个是从未报道过的新突变，这是本文的亮点之一。（2）本文研究手段多样化。尤其是充分利用了生物信息学分析，为研究中的基因结果做出功能学解读，从而扩大了基因型的价值。（3）完整详尽的临床资料。不仅包括病人病史及治疗史、症状、基因测序等，还对携带靶基因突变的患者家属进行家系分析，利用计算机建模方式对鉴定出的基因突变的功能进行预测等，也很好地借助MRI，心理评测等方面对病人除原始症状之外的其他可能出现的症状进行检测排查等，研究内容十分丰富，庞大的工作量和跨领域合作也是本文能发高分杂志的原因之一。当然，本文已经详细解释了开头所提出的研究目的，但是，关于KMT2B仍有一些问题尚待解决（不算是文章局限性，可以归类为研究计划或展望），即先前也报道过四种KMT2B的无症状携带者，这表明某些KMT2B突变对疾病的外显率不完全，其他与肌张力障碍相关的基因（如DYT1和THAP1）也存在类似的情况，但是内在机制尚未阐明，因此这也可以作为未来的一个潜在的研究方向。Hanson解读之所以推荐这篇论文，是因为这篇论文与之前的推荐有同样的特点：A,可以在其他疾病中复制的论文模板。B,临床医生很容易完成。C,作者的选题是一个医生很熟悉的课题。论文之所以能够发表，都是因为有First＆Last之基础。我们一起看看作者如何从生物指标、疾病、预后三个关键点达到这一要求的。1），First-创新性。论文的前言部分已经提出了在该领域的gap：突变截至目前，尚未系统评估儿童期发病的肌张力障碍中KMT2B突变的频率，并且对该表型谱和疾病自然史的描述仍然有限。而该论文的创新性正在于此：针对疾病的某一亚组（KMT2B突变肌张力障碍）进行研究。也这也是我们一直在强调的，针对疾病如何做创新？随着分子诊断的发展，很多疾病都可以分为不同亚组。如自身免疫性疾病根据其致病自身抗体分组、癌症或者其他疾病根据突变基因分组。新分出的亚组就是一个新的未知的临床问题。2），Last-严谨可靠。集中体现在方法学部分，把能够做的都做到位。使得该结果就是一锤定音，哪怕只是在一个极小的点上。本研究中，研究者精确地定义各个观察指标，做了长期随访，资料非常完整。3）临床启发：通过这篇文章，我们其实可以联系到许多其他类型的神经系统相关疾病，比如阿尔兹海默症（AD），帕金森症（PD），亨廷顿症（HD）等，这些疾病已有大量报道证明其与遗传因素的相关性，类似于AD的ApoE4，APP基因等风险基因。但是相关致病基因远不止这些，只有少数病例表现出家族遗传型，大部分都是散发性病例，表示患者间存在明显的异质性，那么是否可以筛查出其他风险基因或者已知基因的新突变呢？这些新基因和新突变是否与某些特定的症状相关，以及是否影响治疗效果和预后呢？截止目前，仍未找到这些疾病的有效治疗手段，很大原因在于病因的多样性，这也为临床研究提供了机会。好了，今天的分享就到这里；希望对您有所启发。也许您很快就可以做出针对您研究疾病的分析。往期精彩合集
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