培养基
培养基是用于提供支持细胞体外生长和维持环境,以产生治疗性蛋白。化学成分限定培养基通常含有由几种能源(如葡萄糖和丙酮酸)、氨基酸(AAs)、盐、微量元素、缓冲液、剪切应力保护剂和维生素,具有特定合适的pH值和渗透压。维生素是细胞生长代谢所必需、功能特异性的一类微量有机物。维生素种类在理化性质和代谢功能上各不相同,维生素可作为辅因子(维生素K和大多B族维生素)、生物抗氧化剂(维生素C和维生素E)、激素(维生素D和维生素A)。维生素的化学结构包含:脂肪族、芳香族、脂环族、杂环和甾类化合物。维生素可分为脂溶性(维生素A、D、E和K)和水溶性(B族维生素和维生素C)两大类,水溶性维生素是带有电荷或极性官能团(如羧基、羟基、磷酰基),脂溶性维生素主要含有长链的烃类结构,通常含有不饱和键。培养基主要的维生素是B族维生素,B族维生素总共包含12种,常见的是9种,其余三种:维生素B4是腺嘌呤、维生素B8是腺嘌呤核苷酸(也称为生物素)、维生素B10是叶酸和其它B族维生素混合物(也称为维生素R)、维生素B11是水杨酸。其降解机制主要分为光照、热、氧化/活性氧(ROS)等。核*素(维生素B2)
功能核*素是核醇和7,8-二甲基异咯嗪缩合而成,由于在异咯嗪的1位和5位的N原子具有两个活跃的双键,易起到氧化还原反应。
核*素转运至胞内形成*素单核苷酸(FMN)或*素腺嘌呤二核苷酸(FAD),三者均作为辅基作用,通过7,8-二甲基异咯嗪上的甲基共价连接至氧化还原酶(*素蛋白)的氨基酸侧链(如半胱氨酸、酪氨酸和组氨酸)的电负性杂原子,影响糖类、氨基酸和脂类代谢。作为参与单电子/双电子氧化还原反应酶的辅因子,已知超过种氧化还原酶(脱氢酶、谷胱甘肽还原酶、加氧酶、氧化酶等)采用核*素作为辅因子,FMN或FAD的氧化性比NAD+和NADP+更强,可以被1~2个电子还原,还原为FMNH2或FADH2。*素参与的氧化还原过程通常涉及加H或去H,以及强氧化过程,如不饱和双键的形成。*素还原后,可以很容易通过O2或NADP+再生,同时产生超氧化物或NADPH。
稳定性和降解核*素在加热、空气和酸性溶液中非常稳定。在碱性条件下会降解成尿素和1,2-dihydro-6,7-dimethyl-2-keto-1-d-ribityl-3-quinoxalinecarboxylicacid。在空气中对光照敏感,在氧气存在条件下,采用UV或可见光照射后,核*素会降解形成各种产物。基于溶液pH和其它成分物质的差异,降解产物也各不相同。核*素在氧气和光照下主要降解产物Formylmethylflavin和lumichrome,其次是carboxymethylflavin;在碱性条件下,也会形成Lumiflavin,在二价离子存在条件下(HPO42?orSO42?)则容易形成cyclodehydroriboflavin。核*素的光敏感性是由于其含有的具有氧化还原活性的芳香族异恶嗪结构所致,在UV照射下催化底物进行氧化。暴露光线下,核*素被激发成短寿命的单重激发态(1Riboflavin*),随后通过系统交叉形成更长寿命的三重激发态(3Riboflavin*),3Riboflavin*(1.7V)核*素(-0.3V)本身具有更强的还原能力,因此可以通过TypeⅠ或TypeⅡ途径,氧化其它物质(包括其他核*素分子)。在核*素光诱导降解氧化的机制中,涉及三个核心成分:①ROS的产生,如单线态氧、超氧阴离子自由基和过氧化氢自由基,②能够被三重激发态降解,同时产生ROS和中间体半醌基核*素的底物基质,③核*素的催化再生。完全还原形式的核*素在空气存在下,易再氧化形成核*素。在避光条件下,核*素是稳定的。光照下,结合其它环境因素会加快核*素的降解水平,如提高环境温度,或者存在金属阳离子下(例如Cu2+或Zn2+通过和异恶嗪结构结合促进光解速率,Fe2+可以直接还原核*素),以及存在碳酸氢钠或提高溶液离子强度。太阳光比紫外线更快降解核*素,且在nm(核*素的吸光度最大值)处照射时降解最快。
培养基成分相互作用通常情况下,核*素不受其它培养基组分影响。但是在光降解下,与其它培养基成分作用加强,并加快自身降解。唯一已知确定的是高浓度硫胺素HCl(相对于核*素浓度)会和核*素反应被氧化,核*素本身形成氯*素沉淀,抗坏血酸存在的条件下会加快氯*素沉淀的产生。
TypeⅠ光氧化容易影响侧链含有杂原子和芳香族基团的氨基酸,如甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸,降解过程和产物将取决于系统中产生/存在的ROS类型,涉及的I型或II型光氧化。关于核*素光诱导氧化的降解过程和特定氨基酸反应的机理,可以查阅问下:蛋氨酸(年)、半胱氨酸(和年)、色氨酸(年)和酪氨酸(年)。
稳定方法培养基避光保存可以有效避免核*素的光降解,或者过滤核*素已知的容易被降解光波长(即波长低于nm)。通过络合剂(