摘要：目的比较乙醇、丙二醇、混合醇（乙醇-丙二醇2∶8）3种柔软剂对制备光甘草定醇质体（GLA-ES）的影响，为难溶性药物的醇质体研究提供柔软剂选择依据。方法分别选用乙醇、丙二醇、混合醇（乙醇-丙二醇2∶8）作为柔软剂，采用注入-超声结合法制备GLA-ES，并进行不同GLA-ES的形态、粒径、Zeta电位、包封率、稳定性和体外释药等考察。以黑色素瘤B16-OVA细胞内酪氨酸酶活性评价GLA-ES抑制黑色素合成能力，采用铁氰化钾还原力实验评估其抗氧化效果，并使用人表皮HaCaT细胞和大鼠皮肤进行初步安全性评价。结果所得GLA-ES为*色半透明液体，具有囊泡状磷脂双分子层结构；光甘草定乙醇醇质体（GLA-Et-ES）、丙二醇醇质体（GLA-PG-ES）和混合醇醇质体（GLA-MA-ES）的平均粒径分别为（34.24±0.29）、（62.31±1.66）、（41.20±1.13）nm，电位分别为（?41.0±1.8）、（?32.9±0.2）、（?35.8±1.6）mV，包封率分别为（91.47±2.39）%、（87.33±1.31）%、（91.39±3.59）%，在4℃放置20d较稳定；其体外释药行为均符合Higuchi方程，具有一定缓释效果。与光甘草定混悬液相比，GLA-Et-ES、GLA-PG-ES和GLA-MA-ES对黑色素瘤B16-OVA细胞的酪氨酸酶活性抑制率分别提高了38.07%、19.58%、40.42%；铁氰化钾还原力实验结果也显示GLA-ES有较强的体外抗氧化作用；GLA-ES对正常细胞几乎没有毒性，对大鼠皮肤无刺激性。结论3种柔软剂均可制备GLA-ES，其抑制黑色素生成、抗氧化作用增强，安全性良好，为进一步开发美白护肤产品或医药外用制剂奠定基础。对于光甘草定这类难溶性药物，选择混合醇（乙醇-丙二醇2∶8）作为柔软剂，所制备的醇质体的包封率、稳定性优于单用乙醇或丙二醇。
光甘草定（glabridin，GLA）是从豆科甘草属植物光果甘草GlycyrrhizaglabraL.根及根茎中提取出来的异*酮类物质[1]，具有抗氧化、抗色素异常沉积、清除自由基[2]以及抑制酪氨酸酶活性[3]等生物活性，可用于皮肤美白、减轻色素沉着和红斑[3-4]。但是光甘草定在水中的溶解度仅为1.5mg/L[5]，几乎不溶于水，致使其生物利用率较低、无法充分发挥生物活性，限制了其在化妆品及外用皮肤制剂中的广泛应用；此外，甘草产地相对固定，且光甘草定提取率低（1.1mg/g[6]），采用增加外用制剂中光甘草定的用量来提高其利用率的方法，成本较高，可行性较差；鉴于此，有必要运用适宜制剂技术来改善光甘草定水溶性以提高其生物利用率。
醇质体（ethosomes，ES）是一种新型柔性纳米脂质体，是由磷脂、水和生物相容性醇如乙醇、丙二醇组成的具有脂质双分子层的囊泡结构，可以包载亲脂性、两亲性和亲水性物质[7-8]，具有制备方法简单、囊泡柔软灵活、包封效率高、稳定性高、细胞毒性低等优良特性[9-10]，可实现皮肤类药物的有效递送。有报道称，醇质体可装载水难溶性药物，在改善其溶解性的同时，还能够提高药物的生物活性[11]。因此，为改善光甘草定的水溶性、提高其生物活性，本实验采用注入-超声结合法制备光甘草定醇质体（GLA-ES），并进行粒径大小、分布、形态等表征，以及稳定性、体外释放度等药剂学评价；在此基础上，考察其抑制黑色素生成、抗氧化等生物活性，并进行安全性评价。以期为将光甘草定有效用于医药外用制剂提供有益参考。
1仪器与材料
1.1仪器
MS-H-Pro+型磁力搅拌器，美国Scilogex公司；CPD型电子天平，德国Sartorius公司；HZS-H性水浴振荡器，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；PHS-25型pH计，上海精密科学仪器有限公司；R型离心机，德国Eppendorf公司；SCIENTZ-IID型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；SpectraMax光吸收酶标仪，美国MolecularDevices公司；ZETASIZERNano-ZS型粒径仪，英国马尔文公司；Agilent高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；HT透射电子显微镜（TEM），日本日立公司；HL-2型恒流泵，上海沪西分析仪器厂有限公司；ESCOCCL--B-8型细胞培养箱，新加坡ESCO公司。
1.2材料与试剂
光甘草定原料，质量分数40%，南京景竹生物科技有限公司；光甘草定对照品，批号JZ18042，质量分数98%，陕西绿清生物工程有限公司；B16-OVA细胞、HaCaT细胞，中国科学院上海生科院细胞资源中心；胎牛血清、PBS、0.25%Tyrpsin-EDTA，美国Gibco公司；DMEM高糖培养基，美国Life公司；卵磷脂，质量分数＞90%，阿拉丁试剂（上海）有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS），陕西九州制药有限责任公司；左旋多巴，阿拉丁试剂（上海）有限公司；酪氨酸酶，美国Worthington生物公司；BCA蛋白检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；MTS细胞增殖试剂盒，美国Promega公司；透析袋，截留相对分子质量，上海源叶生物科技有限公司；羧甲基纤维素钠、氢氧化钠、丙二醇、乙醇、甲醇，国药集团化学试剂有限公司；硫化钠、可溶性淀粉，中国医药集团上海化学试剂公司。
1.3实验动物
SD大鼠，体质量～g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
2方法与结果
2.1GLA-ES制备
采用注入-超声结合法[12]，分别以乙醇、丙二醇、混合醇（乙醇-丙二醇2∶8）为柔软剂制备GLA-ES。称取卵磷脂0.3g、光甘草定原料0.2g，分别加入4mL上述醇溶液使完全溶解；磁力搅拌（r/min）下，缓慢注入6mL含SDS的水溶液，使处方中SDS终质量浓度为0.1mg/mL，继续搅拌5min，室温放置30min使其充分水化，探针超声（90W，6min），离心（r/min，5min），取上清，即得光甘草定乙醇醇质体（GLA-Et-ES）、光甘草定丙二醇醇质体（GLA-PG-ES）、光甘草定混合醇醇质体（GLA-MA-ES）。
不添加光甘草定原料，同法制备空白醇质体。
称取光甘草定原料20mg，加入10mL0.2%CMC-Na水溶液，超声分散使混悬均匀，即得光甘草定原料混悬液（GLAsuspension）。
2.2光甘草定的分析方法
2.2.1光甘草定对照品溶液的制备精密称取光甘草定对照品适量，置于10mL量瓶中，加少量甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为μg/mL的光甘草定浓配液；移取0.5mL浓配液至10mL量瓶中，用流动相稀释并定容至刻度，即得质量浓度为32μg/mL的光甘草定对照品溶液。
2.2.2GLA-ES供试品溶液的制备精密移取GLA-ES0.2mL，置于10mL量瓶中，加适量甲醇，超声15min，放冷，以甲醇定容至刻度，摇匀，取适量离心（10r/min、10min、4℃），取上清，注入高效液相色谱仪进行检测。
取空白醇质体样品，同法制备空白醇质体供试品溶液。
2.2.3液相色谱条件色谱柱为CNWAthenaC18（mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液（78∶22）；检测波长nm；进样量20μL；柱温30℃；体积流量1mL/min。
由图1可知，在该色谱条件下，样品中光甘草定的保留时间与对照品中一致，约为8.6min，且被检测峰与其他杂质峰分离度良好，空白醇质体样品无干扰，表明该方法可以用于醇质体中光甘草定的定量分析。
2.3载药量和包封率测定
采用透析法测定GLA-ES包封率[13]。取“2.1”项下制备的GLA-ES1mL注入透析袋（截留相对分子质量）内，浸没于mL透析介质中，透析3h后，取透析袋内GLA-ES按“2.2”项下方法测定其中光甘草定含量（M包裹），同时测定透析前醇质体中光甘草定含量（M含药量），计算GLA-ES的包封率；根据投入的光甘草定与磷脂的总质量（M总质量），计算GLA-ES的载药量。GLA-ES的包封率和载药量结果见表2。
包封率＝M包裹/M含药量
载药量＝M包裹/M总质量
由表2可知，3种醇质体中光甘草定的包封率均大于85%，其中乙醇醇质体和混合醇醇质体包封率较高，分别为91.47%、91.39%，丙二醇醇质体的包封率稍低，为87.33%；乙醇醇质体和混合醇醇质体的载药量较高，分别为2.46%、2.41%，丙二醇醇质体的载药量稍低，为1.77%。可见，乙醇和混合醇比丙二醇更适于制备GLA-ES，可能是由于浓度适当的无水乙醇增强了双分子层膜的流动性，使双分子层空间增加，从而包封率得到提高[14]。
2.4粒径、PDI和Zeta电位测定
取“2.1”项下制备的GLA-ES溶液适量，用相应比例的水醇溶液稀释10倍后，置于纳米粒度仪测定各醇质体的粒径、PDI和Zeta电位。结果见表3和图2。3种GLA-ES粒径均在30～70nm，且呈现出单一正态分布的窄峰，PDI小于0.3，说明粒径较小，且分布均一；3种GLA-ES电位都小于?25mV，比较稳定；3种GLA-ES外观显示为*色半透明的液体，略泛淡蓝色乳光。
2.5GLA-ES形态学考察
取“2.1”项下制备的GLA-ES溶液，加适量纯水稀释后滴加在铜网上，用2.0%磷钨酸负染，自然晾干，在TEM下观察GLA-ES的形态。结果见图3。
由图3可以看出，光甘草定乙醇醇质体、丙二醇醇质体和混合醇醇质体均呈现出类球状囊泡结构，有可见层纹状结构，与文献报道相符[15]，粒径在40nm左右，且粒径分布较均一，与粒径仪测定的结果一致。
2.6稳定性考察
取“2.1”项下制备的GLA-ES，于4℃放置，分别于0、5、10、15、20d取样，按“2.3”与“2.4”项下方法，测定光甘草定含量、醇质体粒径、PDI等，考察其放置稳定性，结果见图4。在4℃放置过程中，光甘草定乙醇醇质体粒径有增大趋势但仍小于60nm；丙二醇醇质体和混合醇醇质体粒径变化较小，且3种醇质体PDI均小于0.3；此外，3种醇质体中光甘草定的含量基本无变化。表明所制备的GLA-ES在4℃放置稳定性良好，且以丙二醇、混合醇制备的GLA-ES稳定性更优，可能是因为乙醇具有挥发性、对卵磷脂有一定溶解性，易造成囊泡聚集所致；但丙二醇黏度大、不易挥发，混合醇醇质体中丙二醇含量也较大，减弱了其中少量乙醇对稳定性造成的不良影响[14,16]。
2.7体外释放度考察
采用透析法进行GLA-ES体外释放度考察[17]，取“2.1”项下制备的光甘草定乙醇醇质体、丙二醇醇质体、混合醇醇质体、光甘草定原料混悬液各1mL，注入透析袋（截留相对分子质量）内，浸没于50mL35%乙醇水溶液中，平行3份，置于37℃水浴振荡（r/min），分别于1、2、4、8、12、24、48h取样1mL，同时补充1mL同温度空白释放介质，按照“2.2”项下方法测定样品中光甘草定质量浓度，计算各时间点光甘草定的累积释放率，绘制释放曲线，结果见图5。光甘草定混悬液在8h累积释放率为48.38%，高于3种醇质体，之后释放速度减缓，GLA-Et-ES和GLA-MA-ES在48h时的累积释放率分别为57.78%和54.22%，低于光甘草定混悬液的62.94%，表明以乙醇、混合醇制备GLA-ES后可减慢药物释放；GLA-PG-ES在48h累积释放率为64.45%，稍高于光甘草定混悬液，可能是由于丙二醇黏度较大，在释放介质中产生的渗透压较大所致[9]。对释放度进行方程拟合，相关系数最大者即为最佳拟合方程[16]，GLA-Et-ES、GLA-PG-ES和GLA-MA-ES的体外释药行为均符合Higuchi方程，分别为Q＝11.t1/2－4.（r2＝0.）、Q＝12.t1/2－6.（r2＝0.）、Q＝10.t1/2－4.（r2＝0.），具有一定缓释效应。
2.8生物活性测定
2.8.1酪氨酸酶活性抑制能力取密度为0.8×个/mL的B16-Ova细胞混悬液2mL，接种至6孔板，置于37℃培养箱（5%CO2）中培养，待细胞贴壁后，吸弃旧培养液，分别加入2mL含GLA-ES或混悬液的DMEM培养基溶液，其中光甘草定质量浓度为4μg/mL，以空白DMEM培养基为对照，置培养箱中孵育48h。取出，加入1%Triton-XμL裂解0.5h，10r/min、4℃离心10min。取50μL上清液加入96孔板中，另加50μL3mmol/L的左旋多巴溶液，37℃恒温反应2h，采用酶标仪于nm处测定各样品的吸光度（A）值，同时用BCA蛋白检测试剂盒测定各细胞样品蛋白浓度，计算酪氨酸酶相对活性[18]，采用SPSS21.0统计软件对数据进行处理，实验结果以表示。采用组间t检验，P＜0.05表示具有显著性差异，结果见图6。GLA-Et-ES、GLA-PG-ES和GLA-MA-ES作用于B16-Ova细胞后，细胞酪氨酸酶的相对活性分别为（61.60±4.84）%、（80.09±1.67）%和（59.25±1.23）%，均低于光甘草定混悬液（P＜0.05），表明GLA-ES能够抑制B16-Ova细胞的酪氨酸酶活性。可能与以下2方面原因有关：（1）光甘草定被制备成醇质体后，溶解性增加；（2）载药醇质体囊泡能够与细胞膜融合，携带药物进入细胞；从而使光甘草定的生物活性得以充分发挥[14]。
酪氨酸酶相对活性＝(A样品×对照组蛋白浓度)/(A对照×样品蛋白浓度)
2.8.2抗氧化活性（铁离子还原能力的测定）进行铁氰化钾还原力测定考察GLA-ES的抗氧化活性[19]。分别移取光甘草定质量浓度为、、、μg/mL的混悬液与醇质体溶液1mL，加入2.5mL磷酸盐缓冲溶液（pH6.6）和2.5mLK3Fe(CN)6溶液（1%），50℃水浴加热20min。迅速冷却，加入2.5mL三氯乙酸溶液（10%）终止反应，0r/min离心10min，取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水及0.5mLFeCl3溶液（0.1%）。室温放置10min后，使用紫外-可见光分光光度仪在nm处测定样品的A值，结果如图7所示。光甘草定质量浓度在～μg/mL时，光甘草定混悬液与铁氰化钾反应后的A值由0.±0.增加至0.±0.，呈质量浓度相关性；GLA-Et-ES的A值由0.±0.增加至0.±0.，且相同质量浓度下GLA-Et-ES溶液的A值均大于混悬液；GLA-PG-ES、GLA-MA-ES也表现出与GLA-Et-ES类似的变化趋势；表明光甘草定制备成醇质体后，还原能力强于光甘草定混悬液，具有较强的抗氧化能力，这可能是醇质体提高了光甘草定的溶解度，使其生物活性得以充分发挥所致。此外，在相同光甘草定质量浓度下，GLA-Et-ES、GLA-MA-ES的A值比GLA-PG-ES的高，可能因为乙醇对光甘草定的溶解效果更佳，与上述包封率结果相同。
2.9安全性评价
2.9.1细胞毒性取密度为1.3×个/mL的HaCaT细胞悬液μL接种于96孔板，置于37℃培养箱（5%CO2）中培养24h，待细胞贴壁后，吸弃旧培养液，加入μL含GLA-ES（相当含量空白醇质体）的DMEM溶液，每组复3孔，96孔板边缘用等体积纯水填充，置培养箱中孵育48h。吸弃药液后每孔加入μLMTS溶液（MTS-DMEM1∶5），置培养箱中孵育1h，酶标仪于nm波长处检测各孔的A值，计算细胞生存率，结果见图8。当光甘草定质量浓度在0.05～3.00μg/mL时，GLA-ES作用HaCaT细胞48h后，细胞生存率均在90%以上，说明GLA-ES对HaCaT细胞的毒性较弱，即GLA-ES对人皮肤细胞安全性较好。
细胞生存率＝(A样品－A空白)/(A溶剂对照－A空白)
A样品为醇质体作用细胞后A值，A溶剂对照为空白醇质体作用细胞后A值，A空白为调零组A值
2.9.2皮肤刺激性取健康的雄性SD大鼠3只，按照0.mL/gip10%水合氯醛使麻醉，用自配的脱毛膏（分别称取2g洗衣粉、6g硫化钠、14g淀粉，加适量温水调至膏状）涂布于背部脊椎两侧，脱毛膏完全覆盖大鼠毛，脱毛面积约为4cm×2cm，5min后，用温水擦净脱毛部位，静养24h后，划分脱毛区，涂抹3种空白醇质体和3种GLA-ES各μL。每天2次，连续7d，观察皮肤是否出现红斑和水肿，结果见图9。
3种空白和光甘草定载药醇质体给药7d后，大鼠皮肤均没有出现红斑和水肿，和生理盐水作用后没有明显差异，说明空白醇质体和光甘草定载药醇质体对皮肤没有刺激性。
3讨论
本实验所用的GLA-ES制备工艺，是在前期对制备方法、注入搅拌速度、超声时间及功率等工艺因素考察，以及表面活性剂、醇种类、磷脂浓度等处方因素考察的基础上而得出的较优工艺。所得GLA-ES，为*色半透明液体，具有磷脂双分子层的囊泡结构，粒径为30～70nm，且分布较均一，Zeta电位均小于?25mV，包封率高于85%。
由于高浓度醇（通常为乙醇）的存在，醇质体囊泡具有高度延展性，能有效包封亲水性、亲脂性小分子药物[20]，但其稳定性和安全性欠佳，有研究使用丙二醇替代乙醇制备醇质体，以克服其稳定性与潜在安全性问题[21]。本实验使用乙醇、丙二醇和混合醇制备了3种GLA-ES，结果显示，GLA-Et-ES和GLA-MA-ES包封率略高于GLA-PG-ES，GLA-MA-ES和GLA-PG-ES的稳定性比GLA-Et-ES更好，这与乙醇对药物的溶解性和其自身的挥发性有关，与文献报道相符[9]。
对于难溶性药物而言，乙醇醇质体可提高其溶解度，但稳定性略差；丙二醇黏度大，稳定性好，但其对药物的溶解能力有限，作为柔软剂所制得醇质体的包封率和生物活性均不如乙醇醇质体[14,16]。乙醇和丙二醇按一定体积混合后，不仅能保证醇质体的包封率，还能提高其稳定性和药物生物活性。因此，使用混合醇（乙醇-丙二醇）作为柔软剂制备难溶性药物的醇质体是一种较好的选择。
光甘草定具有抑制黑色素合成[22]而发挥皮肤美白作用。酪氨酸酶为皮肤黑色素合成的关键酶和限速酶，抑制酪氨酸酶的活性可阻止黑色素的形成[23]；B16-Ova黑色素瘤细胞，其黑色素形成过程和机制与人体皮肤色素细胞一致[24]。因此，本实验以B16-Ova细胞为研究对象，通过考察光甘草定及其醇质体对该细胞中酪氨酸活性的抑制作用，来评价其潜在的美白效应。结果表明，光甘草定制备成醇质体后，对B16-Ova细胞中酪氨酸酶活性的抑制作用增强，提升了光甘草定的生物活性。
文献报道，光甘草定作为光果甘草中特有的异*酮类成分，具有抗氧化作用[25]，本实验采用铁氰化钾还原力实验来考察光甘草定及其醇质体的抗氧化作用。抗氧化物质通常会将铁氰化钾K3Fe(CN)6还原成亚铁氰化钾K4Fe(CN)6，K4Fe(CN)6再与Fe3+作用，会生成nm波长处有最大吸收的普鲁士蓝，通过测定普鲁士蓝的生成量（吸光度值），能够反映抗氧化物质的还原能力[25]。本研究发现，GLA-ES溶液的A值均大于其相应混悬液，说明光甘草定制备成醇质体后，抗氧化能力增强。
综上，光甘草定制备成醇质体后，由于水溶性得到改善，其抑制黑色素生成、抗氧化作用增强，安全性良好，为将其后续开发成美白护肤产品或医药外用制剂提供参考与借鉴。
参考文献（略）
来源：阳天舒，韩晓乐，孙嘉彬，杨骏，谢燕．光甘草定醇质体制备及其生物活性评价[J].中草药,,51(18):6-.
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