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文献分享米曲霉中自克隆载体表达的果胶 [复制链接]

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文章标题:Homogalacturonanandxylogalacturonanregionspecificityofself-cloningvector-expressedpectinmethylesterases(AoPME1–3)inAspergillusoryzae

发表期刊:EnzymeandMicrobialTechnology

影响因子:3.

发表时间:.8.12

Introduction

引言

曲霉丝状真菌利用其高产酶率,利用遗传重组积极繁殖,并产生了许多转基因生物来生产酶制剂。然而,转基因生物在食品中的使用遭到强烈反对,因此这些生物一般被用于食品生产以外的领域。相比之下,当利用基因重组技术繁殖生物体,而转移到宿主体内的核酸物质为同一物种时,则将构建的菌株视为自克隆菌株,不属于转基因生物。米曲霉是安全的,具有较高的酶分泌能力。此外,由于整个基因组序列已确定为,利用该真菌建立一个自克隆系统将使多种酶的高产,可用于食品工业。

Abstract

简介

本研究构建了米曲霉高表达自克隆载体,并利用该新表达系统产生了3种米曲霉衍生的果胶甲基酯酶(PMEs),并选择其作为模型酶来证明该系统的有效性。

Graphicinterpretation

图文解读

图1:米曲霉自克隆载体pSENself2的构建方案示意图。上标的单星号和双星号分别表示去磷酸化和磷酸化。从S-1到S-13的数字表示表1中提到的构造步骤。

表1:米曲霉自克隆载体pSENself2的构建。

图1和表1描述了构造pSENself2的步骤。

★★★

表2:不同来源果胶的糖的组成。

表2总结了底物的糖组成、甲基化程度(DM)和乙酰化程度(DAc)。可以看出,苹果果胶的GalA和DM大大高于大豆果胶。

★★★

图2:AoPME1、2、3的表达。(A)含Aopme1、2、3的米曲霉转化菌培养上清液的SDS-PAGE分析。M,分子标记;NC:宿主菌株米曲霉NS4培养上清;1、2、3为含Aopme1、2、3的米曲霉转化子培养上清。(B)经或不经糖苷酶H处理的纯化AoPME1、2和3的SDS-PAGE分析。M,分子标记;1、3、5分别为AoPME1、2、3(未加糖苷酶H处理);2、4、6分别为AoPME1、2、3(用糖苷酶H处理)。

如图2A所示,含有Aopme1、Aopme2或Aopme3的重组体分别过量产生40kDa、37kDa或33kDa的蛋白,而AoPME1和2则出现了弥散带。如图2B所示,经内糖苷酶H处理后,AoPME1和AoPME2的分子质量分别下降到39kDa和34kDa,条带不再弥散。以上结果表明,这两种酶均含有N-连接碳水化合物。

★★★

图3:转化子的Southernblot分析。(A)以终止子为探针对转化子进行Southernblotting。(B)以pUC为探针对转化子进行Southernblotting。琼脂糖凝胶电泳后,用溴化乙啶染色(AGE)和Southern印迹法观察DNA片段。左边、中间和右边的面板分别显示来自包含Aopme1、Aopme2和Aopme3的数据。M,大小标记;H,宿主菌株;P,含有一个完整pE12T-sC拷贝的转化子;转化株,不同的菌株显示酶的产生。开口三角形,单拷贝插入;闭合三角形,多拷贝插入。(C-E)米曲霉转化子基因组中整合为一个拷贝或两个拷贝的表达盒示意图。(C)包含Aopme1的转化株。(D)包含Aopme2的转化株。(E)包含Aopme3的转化株。

如图3A所示,终止子用作探针时,每个转化株都有两个条带(Aopme1是5.2kbp和6.5kbp,Aopme2是6.7kbp和11.6kbp,Aopme3是4.8kbp和6.5kbp),表明同源多拷贝插入了基因位点sC(图3C、D、E),Aopme1、Aopme2和Aopme3转化子在3.6kbp、6.0kbp和5.6kbp探测到的信号来自宿主基因组的一个内源性终止序列。相比之下,当使用pUC作为探针时,在自克隆菌株中未检测到条带(图3B)。基于这些结果,高表达Aopme1、Aopme2和Aopme3的米曲霉转化子被证实为不含pUC来源的外源DNA的自克隆菌株。

★★★

表3:温度和pH对AoPME1、2、3的影响。

总的来说,三种酶的理化特性基本相似。

★★★

表4:AoPME1、2和3对不同果胶的底物特异性。

作者对不同来源的果胶进行了酶活性评价,包括柑橘、大豆和豌豆(表4)。AoPME2在苹果和柑橘果胶上表现出显著活性,但在大豆和豌豆果胶上表现出微量活性。相比之下,大豆和豌豆的果胶是AoPME1的首选底物(高于苹果和柑橘)。然而,AoPME3对所有四种测试底物的活性都很低。

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图5:豌豆果胶主链协同消化的HPAEC分析。(A)在存在或不存在PMEs的情况下,内切多聚半乳糖醛酸酶处理豌豆果胶主链酶产物的HPAEC分析。在20mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)中,内切多聚半乳糖醛酸酶(20mU)、AoPMEs(mU)和μL0.5%豌豆果胶主链组成反应混合物。所有反应在30℃过夜。(B)在有或没有PMEs的情况下,用内切木糖聚半乳糖醛酸酶处理豌豆果胶主干酶产物的HPAEC分析。实验是在与(A)相同的条件下进行的,但用内切木糖聚半乳糖醛酸酶取代内切多聚半乳糖醛酸酶。(a)无PME;(b)有AoPME1;(c)有AoPME2;(d)有AoPME3;GalA2,乳糖醛酸,GalA3,半乳糖醛酸;GalA4,四半乳糖醛酸。

如图5A所示,与PME不存在时相比,AoPME1或AoPME2存在时,内切多聚半乳糖醛酸酶的降解产物量增加。相比之下,AoPME3对内切多聚半乳糖醛酸酶降解产物的释放量没有影响,说明AoPME3对汞中甲氧基的活性较低(或无活性)。

当内切木糖聚半乳糖醛酸酶与豌豆果胶主链在AoPME1或AoPME3存在的情况下孵育时,HPAEC检测到大量的木糖基化GalA(Xyl-GalA)(图5B),以及少量的GalA。相反,在AoPME2存在时,PcPGX3的降解产物没有发现。这些结果表明AoPME1和AoPME3可以作用于底物XGA区域的甲氧基,而AoPME2不能。

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图6:AoPME1、2、3的多序列比对。三种酶和两种酶中保留的残基分别以黑色和灰色突出显示。保守的催化残基和参与底物结合的残基分别用空心三角形和实心三角形标记。

与其他两种酶相比,AoPME3的比活性很低。为了研究这种低活性的原因,作者对这三种酶的氨基酸序列进行了比对(图6)。然而,之前为PME确定的催化和底物结合残基在所有三种酶中都是保守的,AoPME3比活性低的原因难以明确。

★★★

图7:真菌PMEs分子系统发育树。

利用本研究中描述的三种AoPMEs和其他多种真菌PMEs构建了分子系统发育树。

SummaryandOutlook

总结与展望

PMEs是食品工业中重要的酶,应用范围广泛,包括果汁和葡萄酒的澄清,水果和蔬菜的种植,以及调整果胶的酯化程度。作者在本文中所报道的关于PMEs底物特异性的研究结果将引导PMEs在食品制造领域的新应用的发展。

Originallink

原文链接

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