NatureChemistry
短波红外多甲基荧光体匹配激发光源能够实现在体内无创，多色实时成像
大家好，今天给大家推荐一篇NatureChemistry上的文章，通讯作者是加州大学的OliverT.Bruns教授。
高分辨率、多路复用实验是细胞成像的主要内容。然而，由于在可见光(-nm)和近红外(-nm)波长下组织中存在大量的散射和自发荧光，在动物身上进行类似实验具有挑战性。研究人员利用量子点、荧光标记的二氧化硅粒子、荧光蛋白和表面增强拉曼散射纳米颗粒探索了在小鼠身上实现非侵入性多路成像的方法。虽然取得了重大进展，但这些方法在空间和时间分辨率上都很低，限制了生物信息的获取。
为了在动物体内实现稳定的、实时的、多路复用成像，必须要检测提供高空间分辨率的电磁波谱区域;建立有效的正方向激发和/或明亮荧光团的检测;在毫秒级时间尺度上快速检测每个通道。本文提出了一种方法，满足这些要求，并实现了高空间和时间分辨率的全动物、三色成像。该技术的关键是实现激发多路复用和色盲单通道检测由明亮的、激发光相匹配的多甲基荧光团发出的低能量短波红外(SWIR,-nm)光（图1a）。该方法解决了高时间分辨率的多色SWIR成像，促进了亚毫米分辨率下生物过程的实时分析(27帧/秒)。通过激发波长和使用单一SWIR检测通道来区分造影剂。这种被称为激发多路复用的方法具有优势，因为在所有通道中都能获得相同的分辨率，光子效率高，并且易于在单个检测器上快速采集每一帧。激发多路复用最初应用于单分子光谱法、显微镜法和低浓度DNA测序。但是激发多路复用方法还没有适应于动物体。在SWIR中实现激发多路复用是特别有益的，因为激发可以为每个荧光团进行优化，光子可以在很宽的波长范围内被探测到。这些特性结合在一起使SWIR造影剂获得的信号最大化，与可见光和近红外光相比，SWIR造影剂具有固有的低量子产率。为了在动物体内进行实时的多路激发，需要使用吸收光谱与普通的低成本激光线兼容的明亮的SWIR发射造影剂(图1b)。多甲基染料是激发复用的合适造影剂，因为它们具有吸收带窄而吸收系数高的特点，其中最杰出的一种是吲哚菁绿(ICG)。同时，我们报道了一种用于SWIR光学成像的多甲基染料。这种染料，Flav7(图1c)，具有SWIR吸收和高亮度的SWIR区域。自从引入Flav7以来，利用类似的方法设计出许多用于SWIR成像的多甲基染料。
为了实现这种多路复用策略，需要对Flav7的结构进行修改，以调整最大吸收波长(校准最大值，abs)，以匹配用于SWIR成像的可获得的激发波长。为了实现这一目标，我们开始通过杂环改性对*酮多甲基染料的吸附性能进行微调。这项工作最终使我们获得了一套最适合实时、多色SWIR成像的染料(见图2a)。开发了一种替代方法，依赖于关键的7-取代的*酮中间体，该中间体可通过亲核试剂甲基处理和脱水转化为所需的杂环。利用三种合成*酮类化合物的一般路线
1)门氏酮的合成；(2)Buchwald-Hartwig三氟酸偶联使7-羟基*酮功能化处理；(3)商品化的7-氨基*酮的酰化，我们得到了一系列不同的7-氨基*酮杂环化合物。然后，通过每个*酮杂环与相关的双(苯基)多甲基链的碱基促进反应，得到了七甲胺染料1-11(图2a)。我们对1-11在二氯甲烷(DCM)中的光物理性质进行了表征，发现*酮七甲胺染料的吸收/发射跨越了电磁光谱的近红外到SWIR区域(图2a-c，表1)。与Flav7(1)相比，9和10出现蓝移。7-甲氧基取代染料10与Flav7相比蓝移了约43nm(λmax,abs=nm)，类似于未取代的*酮染料11(IR-27)。相反，与Flav7相比，染料3和7显示了实质性的红移。二苯胺取代7红移约23nm，而久洛利定衍生物3红移约35nm(λmax,abs=nm)。
将九种染料的吸收/发射波长与Hammettσm值进行绘图，结果显示出很强的相关性(r2=0.96)（图2d）。为预测荧光团结构以匹配任何期望的激发波长提供了机会。我们发现，其吸收系数在,~,M?1cm?1之间变化，符合聚甲基荧光团的高吸收截面特征。荧光量子产率(ΦF;染料IR-26的相对测量值=0.05%）保持相当稳定，在~0.4%0.6%的范围内。较高的和相对一致的ε和ΦF值使得一系列从-nm的明亮染料(图2b;表1)可用于在SWIR区域实时激发多路复用。图2e，候选的激发多路成像染料中，其中3在nm处成像更优(亮度(ε)=±40M?1cm?1),10在nm处(亮度(ε)=±20?1cm?1)成像更优。
通过观察同一幅图上的吸收剖面和激发波长，可以进一步观察这种激发匹配的感觉(图3a)。采用ICG，它与普通的纳米激光器很好地匹配，增加了第三种颜色。3和10的水溶物显示聚集，降低了水环境中发射物的浓度，但没有实质上改变它们的激发或发射剖面(图3b-d)。通过含有ICG(图3e，左)、MeOFlav7(10中);和JuloFlav7(3;右)的成像管在有机溶剂(上)和在水中的胶束(中)，证实了激发多路复用可以在水溶液中或有机溶剂中进行。在每一种情况下，用、和nm激光连续采集的三帧图像分别在左、中、右样品中显示高强度。合并三个帧在一起产生一个代表一个有效多路复用帧的三色图像。因为分子在比s0到s1转换低的能量下吸收最小的光，所以串扰主要发生在一个方向上。线性解混合可以校正通道间的小信号重叠，如图3e(底部)所示。在活体实验中，首先进行MeOFlav7(10)腹腔注射，然后进行JuloFlav7(3)静脉注射，最后进行ICG(图3f)，在体内进行三色成像。图3g显示了三色视频的代表性时间点。每个染料在任何位置上的(生物)分布可以通过三个通道的相对贡献来确定，就像在单通道图像中看到的那样。
高速SWIR成像使18只清醒小鼠的无接触生理监测成为可能。由于帧速率比动物的宏观运动快，清醒动物的心率和呼吸速率可以被量化。通过观察三种颜色的清醒的、未受麻醉干扰的老鼠来进行这项技术。在图4a中，我们在给MeOFlav7(10)和JuloFlav7(3)和ICG连续给药后80分钟进行清醒小鼠成像。移动小鼠俯视图，ICG仅在肝脏可见，MeOFlav7(10)在腹部可见，而JuloFlav7(3)在整个小鼠中仍然存在。除了评估自然生理的能力，如清醒呼吸率(图4b，这里量化为每分钟次呼吸)，非接触，这些工具还预示了更复杂的实验，在这些实验中，可以纵向、无创、无麻醉地监测多个探针的位置。此外，可以监测两种生物在相同器官的体内分布情况。例如，可以观察到每个探针肝脏的积累和清除。我们通过尾静脉连续注射JuloFlav7(3)和ICG，并在1小时内在多个时间点对整个小鼠进行成像(图4c)。在实验期间，来自通道的肝脏信号保持不变，而通道的信号随着时间的推移而损耗。(图4d)。通过激发多路复用获得的快速采集速度使尸体解剖和手术期间能够实时反馈(50帧/秒，两种颜色)(图4e)。文中报道的方法不仅适用于非侵入性成像还帮助外科医生在术中识别重要的或病变结构过程至关重要。
随后静脉注射JuloFlav7(3)，立即填充血管(图5a-c)。以21帧/秒的速度在两个通道采集图像，得到高空间和时间分辨率的图像，并将淋巴管与静脉和动脉分开显示(图5d-e和补充图12)。值得注意的是，每个血管的功能，通过一个线性截面的信号，可以实时观察到(图5f)。鉴别淋巴和循环结构并同时监测其功能的能力对非侵入性诊断以及扩大荧光引导手术的技术手段具有重要意义。
本文通过设计针对短波红外(SWIR,-nm)区域的光学造影剂，以及与之相配套的先进成像技术，在动物身上实现了实时、无创的多色成像实验。开发了可调谐的SWIR发射型*酮多甲基染料，并建立了这类明亮的SWIR造影剂的结构和光物理性质之间的关系。同时，设计了一个具有可变近红外/SWIR激发和单通道检测的成像系统，便于光学引导手术的视频速率多色SWIR成像和清醒和移动小鼠的多路检测成像。优化的染料匹配nm和nm激光器，结合临床批准的吲哚菁绿（ICG），实现了具有高时间和空间分辨率的实时三色成像。
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